Лаборатория ветеринарно-санитарной экспертизы

12. Лаборатория ветеринарно-санитарной экспертизы

Перечень основного оборудования в лаборатории

Лаборатория ветсанэкспертизы на Таганском мясоперерабатывающем предприятии оснащена достаточно современным оборудованием.

Для взвешивания проб имеются технические весы, а также для большей точности в пользовании сотрудников имеются аналитические весы.

Для проведения физического анализа на влажность мясной продукции, а также для удаления влаги из песка (используемого для определения той же влаги в пробе) в рабочем состоянии находятся два сухожаровых шкафа на 120⁰C и на 50⁰C; автоклавы, термостаты. Для хранения реактивов, по инструкции нуждающихся в хранении при низких температурах (+4 - +6⁰C), лаборатория оснащена холодильником. В пользовании сотрудников лаборатории имеется электрическая мясорубка, предназначенная для измельчения и придания однородности пробе. Для проведения анализа на содержание нитрита натрия в исследуемой пробе сотрудники пользуются полуавтоматическим прибором фотометр «КФК-3». Электрическая плитка для проведения анализа на количество содержащейся соли в пробе колбасных изделий (водяная баня). Также в достаточном количестве физико-химический отдел снабжен различной лабораторной посудой.

ü  определение общего количества микробов в 1 г продукта

ü  определение бактерий групп кишечной палочки в 1 г продукта

ü  определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта

ü  определение сульфитвосстанавливающих клостридий

ü  определение Proteus в 1 г продукта

ü  определение коагулазоположительных стафилококков в 1 г продукта

ü  определение L. monocytogenes в 25 г продукта

ü  определение дрожжей и плесеней

В основном пробы колбасных изделий берут с каждой партии товара, выпущенной одной сменой. Также поступают образцы испытательной продукции из технологического отдела.

Согласно ГОСТу 9958-81 проведение анализов в микробиологическом отделе осуществляется следующим способом.

Отбор проб для бактериологических испытаний (ГОСТ 9792-73)

Для бактериологических испытаний пробы отрезают стерильным ножом или другими стерильными инструментами. От изделий в оболочке и продуктов из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц массой более 2 кг – в количестве двух для всех видов испытаний причем при одновременном отборе единиц продукции для органолептических, химических и бактериологических испытаний от каждой единицы продукции в первую очередь отбирают для бактериологических испытаний. От изделий без оболочки – не менее трех для каждого вида испытаний. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному из показателей проводят повторный отбор удвоенного количества единиц продукции. Результаты повторных испытаний распространяются на всю партию.

Отбор проб для органолептических и химических испытаний

Из отобранных единиц продукции берут точечные пробы и из них составляют объединенные пробы.

Определение общего количества микробов в 1 г продукта

Метод не распространяется на сырокопченые колбасы.

Сущность метода заключается в способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре (30 + 0,5)⁰C с образованием колоний, видимых при увеличении 5^*.

Проведение анализа

Питательный агар расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 45⁰C. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта. Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одну чашку Петри проводят посев 0,1 г, а на другую – 0,01 г продукта.

Для посева 0,1 г продукта готовят первое десятикратное разведение испытуемой взвеси: стерильной пипеткой с широким концом отбирают 5 см³ испытуемой взвеси (приготовленной по), переносят ее в пробирку с 5 см³ стерильного физиологического раствора или пептонной воды. Конец пипетки должен быть опущен ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. 1 см³ полученного раствора содержит 0,1 г испытуемого продукта. Другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки продуванием, отбирают 1 см³ и переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.

Для посева 0,01 г продукта готовят следующее разведение: другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора. 1 см³ испытуемого раствора вторичного разведения содержит 0,01 г испытуемого продукта. 1 см³ этого раствора переносят в стерильную чашку Петри, как описано выше. При необходимости таким же образом готовят следующие разведения. После внесения разведения анализируемой взвеси в чашки Петри чашку заливают 12 – 15 см³ расплавленного и охлажденного питательного агара при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Быстро смешивают с мясопептонным питательным агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых участков дна чашки Петри, попадания среды на края и крышку чашки.

Для того, чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий группы протея в Н-форме, допускается наслоение расплавленного и охлажденного до температуры 45 – 50 °С голодного агара толщиной 3 – 4 мм. После застывания агара чашки Петри перевертывают и помещают в термостат с температурой 30 ⁰C на 72 ч. Через 72 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на чашках. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

Обработка результатов

Для определения общего количества микробов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта.

За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимают среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.

Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта.

Сущность метода заключается на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах «ХБ», Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления лактозы. Цель определения этой группы бактерий – проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий.

При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации.

Проведение анализа

В пробирки, содержащие по 5 см³ – среды «ХБ», среды Хейфеца двойной концентрации или среды КОДА, вносят по 5 см³ испытуемой взвеси стерильной пипеткой вместимостью 5—10 см³ с широким концом.

Допускается применение среды Кесслер по 10 см³.

Пробирки со средой «ХБ» или Кесслер, или Хейфеца, или КОДА помещают в термостат с температурой (37 ± 0,5) °С на 18 – 20 часов.

Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 °С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения).

При росте бактерий группы кишечной палочки среды «ХБ» и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца приобретает также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.

Для окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца ( изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева, или Левина. Чашки Петри помещают в термостат с температурой 37 °С. Через 18 – 20 ч посевы просматривают. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева — кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина — темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму.

Специфическое изменение среды «ХБ» и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.

При заведомо высокой обсеменности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помещают в пустую пробирку, в которую закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5x5 см, и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливают среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3/4 высоты пробирки. Пробирки помещают в термостат с температурой 37 °С на 8 – 10 ч. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде «ХБ» и КОДА среда изменяет свой цвет из фиолетово-пурпурного в желтый. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, которым затем может меняться до салатно-зеленого.

Пробы, отобранные с поверхности изделий без оболочки тампонами, анализируют аналогично.

Обработка результатов

Обнаружение грамотрицательных не образующих спор палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.

Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта.

Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств.

Проведение анализа

Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносят во флакон Сокслета, содержащий 100 см³ среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 см³. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат с температурой 37 °С. Через 16 – 24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0,4—0,5 мм) или пастеровской пипетки проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору).

Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 °С; посевы просматривают через 16 – 48 ч, на висмут-сульфит-агаре — через 24 – 48 ч.

На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образует бесцветные или с розовым оттенком колонии.

На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы, как и на среде Эндо — мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.

На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.

На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы и группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.

Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помещают на 12 – 16 ч в термостат с температурой 37 °С.

При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука – розовый, столбик — желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, сероводородообразующие – вызывают потемнение столбика.

Другие грамнегативные бактерии дают следующие изменения цвета среды:

ü бактерии группы кишечной палочки — вся среда окрашивается в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;

ü бактерии из группы протея — среда окрашивается в ярко-красный цвет, может образоваться черный осадок;

ü шигеллы и возбудители брюшного тифа — косяк окрашивается розовый цвет, столбик — в синий или сине-зеленый.

Допускается вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука посев на углеводные среды в короткий пестрый ряд, включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода.

Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют и изучают серологические свойства микроорганизмов путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллез-ной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток.

Установив серологическую группу, которой относятся исследуемые бактерии, с помощью Н-сывороток определяют тип бактерий.

Обработка результатов

Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum и S. gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, неферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с монорецепторными О- и Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.

Определение коагулазоположительных стафилококков

Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков продуцировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

Проведение анализа

Из разведения анализируемой взвеси продукта (1:10) проводят посевы на молочно-солевой агар, содержащий 65 г/дм³ хлористого натрия, для выявления пигмента или желточно-солевой агар, содержащий 65 г/дм³ хлористого натрия, для выявления лецитиназной активности.

Взвесь наносят на поверхность агара в количестве 0,2 см³ и равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды.

Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 °С и 24 часа выдерживают при комнатной температуре.

На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности.

Из подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарате обнаруживается грамположительные мелкие кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.

Для подтверждения признаков патогенности стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции. В прибор с 0,5 см³ цитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:4, вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при температуре 37 °С . Реакцию плазмокоагуляции учитывают через 3 – 4 ч (не встряхивая пробирку) и оставляют в термостате на сутки для окончательного учета через 24 ч.

Для постановки реакции плазмокоагуляции можно использовать также сухую цитратную плазму крови кролика.

Реакцию считают положительной, если плазма коагулируется в сгусток.

Обработка результатов

Для определения количества стафилококков учитывают колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляции.

При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на количество посевного материала.

Определение сульфитвосстанавливающих клостридий

Сущность метода заключается в специфическом росте сульфатвосстанавливающий клостридий в средах СЦС, Вильсон-Блера, ЖСС-1 и ЖСС-2, на которых в результате восстановления сернистокислого натрия в сернокислый натрий происходит взаимодействие с хлористым железом и образуется почернение среды за счет сернистого железа.

Проведение анализа на среде Вильсон-Блера

В пробирки, содержащие по 9 см³ расплавленной и охлажденной до температуры 45 °С среды Вильсон-Блера (или ЖСС), вносят стерильной пипеткой по 1 см³ десятикратных разведений (от 10^–1 до 10^-7) взвеси испытуемого продукта. Посевной материал и среду тщательно перемешивают.

Посевы помещают в термостат с температурой 46 °С на 8-12 часов 37 °С на 20 часов. Появление в среде черных колоний или почернение всей среды указывает на присутствие сульфитвосстанавливающих клостридий.

Почернение среды Вильсон-Блера могут вызвать многие энтеробактерии. Для подтверждения роста сульфатвосстанавливающих клостридий используют пересев в пробирки со средой Китта-Тароцци, предварительно прогретой в течение 25 минут в кипящей водяной бане и быстро охлажденной до 45 °С. Термостатирование посевов проводят при (37 ± 0,5) °С, ежедневно в течение 5 суток, проверяя в них помутнение среды, выделение газа, появление постороннего запаха, иногда разложение кусочков печени. Сразу после появления признаков роста готовят микроскопический препарат. Материал для этого берут пастеровской пипеткой со дна пробирки. При микрокопировании отмечают грамположительные палочки, образующие овальные споры.

У спорообразующих грамположительных микроорганизмов выявляют каталазную активность с помощью раствора перекиси водорода 30 г/дм³. Отсутствие пузырьков газа при добавлении к капле культуральной жидкости такого же количества перекиси водорода позволяет считать, что в посевах присутствуют микроорганизмы из рода клостридий.

В случае отсутствия спор в микроскопическом препарате положительной пробы на каталазу, присутствия в посевах смешанной микрофлоры, 1—2 капли накопительной среды переносят в стерильную чашку Петри, заливают расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсон-Блера. Застывшую поверхность плотной среды заливают холодным агаром. Посевы термостатируют 24 – 48 ч при (37 ± 0,5) °С. Появление в нижнем слое агара черных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии в посевах сульфитвосстанавливающих клостридий.

Обработка результатов

За положительный титр клостридий (сульфитвосстановителей) принимают то максимальное разведение суспензий, в посеве которого произошло почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10^-1, то считают, что в исследуемом продукте будет 10 (или 1*10¹) клеток в 1 г; если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10^-2, то считают, что в исследуемом продукте — 100 (или 1*10²) микробных клеток в 1 г.