Область применения

1. Область применения

Методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора, других организаций, осуществляющих контроль за качеством продуктов питания и других объектов внешней среды.

2. Сущность метода

Методические указания содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов в пищевых продуктах и других объектах исследования, основанного на регистрации относительного электрического сопротивления питательной среды, происходящего под влиянием процессов роста и жизнеспособности микроорганизмов.

Одной из основных задач, стоящих перед учреждениями Госсанэпидслужбы России в соответствии с Законом РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", является внедрение современных инструментальных методов оценки опасных и потенциально опасных для человека химических, физических и биологических факторов окружающей природной, производственной и социальной среды как в рамках функции Госсанэпиднадзора, так и в системе обязательной сертификации продукции и услуг по показателям ее безопасности для здоровья человека. Классические методы микробиологических исследований, используемые в практической деятельности бактериологических лабораторий учреждений службы, достаточно длительны, трудоемки и позволяют получать результаты через несколько суток, что значительно снижает оперативность и эффективность госсанэпиднадзора, особенно при проведении исследований скоропортящейся продукции.

Существующие в настоящее время микробиологические автоматизированные системы на основе импедансных технологий позволяют получать быстрые (в течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов. В основе метода импедансной микробиологии лежит измерение изменения электрической проводимости питательной среды под воздействием роста микроорганизмов, что впервые было показано Стюартом в 1898 году. Однако этот метод получил свое развитие лишь в 70-е годы с появлением соответствующего электронного оборудования и компьютерной техники. Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов путем определения электрического импеданса. Изменение импеданса происходит в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. При этом незаряженные или слабозаряженные составляющие питательной среды превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры до органических кислот. Эти электрохимические изменения приводят к существенным изменениям импеданса, экспоненциальные изменения сигнала могут наблюдаться, когда количество микробных клеток достигает порога 106 - 107 клеток/мл. Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (IDT), значение которого обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в пробе.

Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических систем, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получил микробиологический анализатор "Бак Трак 4100" производства австрийской фирмы "SY- LAB". "Бак Трак 4100" является автоматизированной системой для ускоренной (в течение 6 - 8 часов) количественной и качественной оценки степени микробного загрязнения продуктов питания, питьевой воды, напитков, парфюмерно-косметической продукции, контроля за стерильностью различных материалов и растворов.

Прибор автоматически определяет основные санитарно-значимые показатели - мезофильные аэробы и факультативные анаэробы, бактерии группы кишечных палочек (колиформы), патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы и листерии), сульфитредуцирующие клостридии, лактобациллы, энтерококки, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, а также дрожжи и плесени. Кроме того, прибор позволяет также определять наличие ингибиторных веществ в различных продуктах и пищевом сырье. Главным преимуществом микробиологического анализатора "Бак Трак 4100" по сравнению с аналогичными приборами других фирм (благодаря наличию двух пар электродов в измерительных ячейках) является одновременная регистрация двух параметров: М-параметр - относительное изменение полного электрического импеданса (сопротивление + емкость) питательной среды и Е-параметр - относительное изменение импеданса в зоне двойного электрического слоя между электродами. Оба электрических параметра показывают высокую степень корреляции с кривой роста, однако сдвиги в концентрации ионов, происходящие в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, сильнее влияют на Е-параметр, чем на М-параметр, который описывает весь объем образца. В системе "Бак Трак 4100" для обнаружения микроорганизмов, вызывающих незначительные изменения проводимости питательной среды (дрожжи и плесени), используется метод "непрямого импеданса". Сущность метода заключается в регистрации СО , образующегося в 2 процессе метаболизма микроорганизмов, в присутствии щелочи:

СО = 2ОН -> СО + Н О.

Наиболее существенным преимуществом метода "непрямого импеданса" является его большая чувствительность. Так, методом "непрямого импеданса" возможно определять 10 - 10 клеток дрожжей в мл, что на порядок ниже по сравнению с прямым. Таким образом, измерительная система прибора "Бак Трак 4100" реализует принцип разделения импедансного сигнала, регистрируя одновременно как импеданс среды, так и электродный импеданс, а также позволяет проводить измерения прямым и "непрямым методом", что делает возможным использование любых (в том числе и отечественных) питательных сред для проведения исследований.

3. Методики определения санитарно-показательных, потенциально патогенных и патогенных микроорганизмов

3.1. Определение мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов

1. Среда BiMedia 001A (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Дать среде BiMedia 001А уравновеситься при комнатной температуре в течение 6 ч.

2.2. Установить температуру 30 -С на приборе "Bac Trac".

2.3. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч.

Пороговые значения (Thresholds): выбирается соответствующий калибровочный файл для данного вида продукции и параметры пороговых значений вносятся автоматически.

Учет результатов проводится по М-параметру.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001A.

4. Внести 1 мл предварительно подготовленного в соответствии с требованиями нормативной документации исследуемого образца продукта в измерительную ячейку с 9 мл среды.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Вас Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически. При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности микроорганизмов в исследуемом образце.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Результат определения КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого продукта. Если исследуется твердый продукт, то результат определения КОЕ (CFU) необходимо умножить на степень разведения (х 10) для получения КОЕ в 1 г продукта. Примечание. Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в гл. 4 данных Указаний.

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек - БГКП (колиформ)

1. Среда BiMedia 160B (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени

(Time limit 1) 12 ч

Пороговое значение по времени

(Time limit 2) 18 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 160B.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие БГКП.

4.1. Если наличие БГКП не допускается в 0,01 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:100.

4.2. Если наличие БГКП не допускается в 0,1 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:10.

4.3. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 5 мл из разведения 1:5 и добавляется к 5 мл среды 160В двойной концентрации.

Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.

4.4. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:10 и добавляется к 90 мл среды BiMedia 160B.

4.5. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:1 и добавляется по 5 мл гомогената в две измерительные ячейки к 5 мл среды 160В двойной концентрации.

Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.

4.6. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:5 и добавляется к 50 мл среды BiMedia 160B двойной концентрации.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160B (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Исследуемое количество продукта содержит единичные клетки БГКП, и проба считается контаминированной колиформами, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 12 ч. При положительном результате наблюдается изменение цвета питательной среды (исходный пурпурный цвет среды меняется на желтый). Дополнение. Если клетки БГКП находились в стрессовом состоянии (термическая обработка, замораживание, высушивание и т.п.), то может наблюдаться более медленный рост культуры с увеличением времени определения по М-параметру до 18 ч. В этом случае проба считается контаминированной, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 18 ч.

3.3. Определение сальмонелл

Определение сальмонелл возможно проводить либо на среде BiMedia 201B, либо на среде BiMedia 205A.

3.3.1. Определение сальмонелл на среде BiMedia 201B.

1. Среда: BiMedia 201B (Rappaport-Vassiliadis) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение.

Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1%-ной пептонной водой или средой Pre-Media 205А в соотношении 1:10.

Тщательно перемешать. Инкубировать в течение 14 - 16 ч при 37 -С.

Период предварительной инкубации для мясных, рыбных и молочных продуктов составляет 7 - 8 ч при 37 -С.

3. Протокол измерения.

3.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 80%

Е-параметр 0 - 80%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 15%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 12 ч 30 мин.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 201B.

5. Внести 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с

10 мл среды BiMedia 201B (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac". Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор.

Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса по Е-параметру превышает 15%-ное пороговое значение в течение 12 ч 30 мин.

9. Подтверждение Salmonella-позитивных образцов. В случае положительного ответа на сальмонеллы проводитсяподтверждение с высевом на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

3.3.2. Определение сальмонелл на среде BiMedia 205A.

1. Среда BiMedia 205A (Selenite-Cystine media) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение. Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1%-ной пептонной водой или средой Pre-Media 205A в соотношении 1:10. Тщательно перемешать. Инкубировать в течение 16 - 18 ч при 37 -С.

3. Протокол измерения.

3.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 30%

Е-параметр 0 - 30%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

Е-параметр 10%

М-параметр 5%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Time limit (пороговое значение по времени) 23 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 205A.

5. Добавить 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 205A (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор.

Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса превышает 10%-ное пороговое значение по Е-параметру и 5%-ное пороговое значение по М-параметру в течение 23 ч.

9. Подтверждение Salmonella-позитивных образцов. В случае положительного ответа на сальмонеллы проводится подтверждение с высевом на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

3.4. Определение энтерококков

1. Среда BiMedia 301А (готовится в соответствии с инструкцией -см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 301А.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие энтерококков.

5. Тщательно перемещать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 301А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен энтерококками, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч.

3.5. Определение Staphylococcus aureus

1. Среда BiMedia (Pre-Media 350A и BiMedia 350A) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Приготовление образца.

Смешать 10 г продукта со стерильной водой в соотношении 1:10, затем тщательно гомогенизировать образец.

3. Предварительное обогащение.

Добавить необходимое количество суспензии продукта, в котором регламентируется отсутствие Staphylococcus aureus (например, 10 мл суспензии, если Staphylococcus aureus определяется в 1 г продукта, и 1 мл суспензии, если Staphylococcus aureus определяется в 0,1 г продукта, к 90 мл или 9 мл среды Pre-Media 350А соответственно).

Инкубировать образец 24 ч.

4. Протокол измерения.

4.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

4.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 30%

Е-параметр 0 - 30%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

Е-параметр 10%

М-параметр 5%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч.

5. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 350A.

6. Добавить 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

7. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 350A (без инокулята).

8. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

9. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Примечание.

Время между внесением предобогащенных образцов в ячейки и загрузкой измерительных ячеек в инкубаторный блок не должно превышать 15 мин. В случае превышения данного интервала времени могут быть получены ложные результаты!

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен Staphylococcus aureus, если изменение импеданса превышает 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч.

10. Подтверждение Staphylococcus aureus - позитивных образцов. В случае положительного ответа на Staphylococcus aureus проводится подтверждение в соответствии с нормативными документами (постановка коагулазного, каталазного тестов и теста гемагглютинации). Материал берется непосредственно из измерительной ячейки.

3.6. Определение листерий

1. Среда Pre-Media 403А и BiMedia 403А (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение.

Для предварительного обогащения используется среда Pre-Media 403А.

Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие листерий, со средой Pre-Media 403А в соотношении 1:10, затем гомогенизировать образец.

Инкубировать образец со средой Pre-Media 403А в течение 24 ч.

3. Протокол измерения.

3.1. Дать среде BiMedia 403А уравновеситься при комнатной температуре в течение 12 ч.

3.2. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.3. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 36 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 20%

Е-параметр 0 - 80%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 15%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 30 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 403А.

5. Добавить в ячейку 0,1 мл предобогащенного образца; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 403А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac". Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: Образец загрязнен листериями, если изменение импеданса превышает 15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.

9. Подтверждение Listeria-позитивных образцов. В случае положительного ответа на листерии проводится подтверждение с высевом на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

3.7. Определение дрожжей и плесеней

Определение дрожжей и плесеней основано на использовании непрямого метода определения изменения импеданса среды. Сущность непрямого метода заключается в следующем: СО, образующийся в процессе роста дрожжей (плесеней), поглощается раствором щелочи, изменяя проводимость среды. Изменение проводимости раствора щелочи регистрируется на приборе "Bac Trac". Для данного метода используются ячейки двух типов: 1) измерительные неавтоклавируемые 10 мл КОН-ячейки (стойкие к воздействию щелочи); 2) автоклавируемые 2 мл криопробирки для исследуемых образцов.

1. Среда BiMedia 501B (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

1.1. Для исследования дрожжей рекомендуется использовать среду BiMedia 501B.

1.2. Приготовить 0,2%-ный раствор КОН (2 г твердого КОН растворите в 1 л дистиллированной воды). Раствор КОН должен храниться в холодильнике тщательно закрытым. Срок хранения раствора КОН - 1 неделя.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 30 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры: Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters): Время исследования (Duration) 24 ч Масштаб измерений (Scale): М-параметр (-90 - 10)% Е-параметр (-90 - 10)% Время задержки (Delay) 1 ч. Пороговые значения (Thresholds): выбирается соответствующий калибровочный файл для исследования дрожжей (плесеней) и параметры пороговых значений вносятся автоматически либо проводить учет по М- параметру (-20%). Установить значение параметра Drop Stop No.

3. В измерительную КОН-ячейку внести 1 мл 0,2%-ного раствора КОН.

4. Внести 1 мл среды BiMedia 501B в стерильную криопробирку.

5. Внести 1 мл предварительно подготовленного в соответствии с требованиями нормативной документации исследуемого образца продукта в криопробирку с 1 мл среды.

6. При закрытии криопробирки необходимо оставить приблизительно 1 мм на резьбе между флаконом и крышкой с тем, чтобы была возможность выхода СО при его образовании и повышении 2 давления в пробирке. Не открывать крышку криопробирки более, чем рекомендовано, так как это может блокировать работу клапанной системы ячейки. Избегайте прикосновения наконечником пипетки к резьбе криопробирки во время ее заполнения. Жидкость может препятствовать выходу газа из ячейки и вызывать ошибочные сигналы.

7. Для контроля использовать одну криопробирку с 2 мл среды (без инокулята).

8. Поместить криопробирку в КОН-ячейку между 4-мя электродами.

9. Тщательно закрыть КОН-ячейку.

10. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

11. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Вас Trac". Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически. При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности дрожжей (плесеней) в исследуемом образце.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Результат определения численности дрожжей (плесеней) КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого продукта. Если исследуется твердый продукт, то результат определения КОЕ (CFU) необходимо умножить на степень разведения (х 10) для получения КОЕ в 1 г продукта.

3.8. Определение лактобацилл

1. Среда BiMedia 620A (готовится в соответствии с инструкцией -см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М- и Е-параметрам.

Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 620A.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие лактобацилл.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 620A (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен лактобациллами, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч.

3.9. Определение сульфитредуцирующих клостридий

1. Среда BiMedia 660A (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 43 - С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры: Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters): Время исследования (Duration) 24 ч Масштаб измерений (Scale): М-параметр 0 - 50% Е-параметр 0 - 50% Время задержки (Delay) 1 ч Пороговые значения (Thresholds): М-параметр 5% Е-параметр 10%. Проводить учет результатов по М-параметру. Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч. Определение сульфитредуцирующих клостридий необходимо проводить, используя измерительные ячейки для анаэробов (измерительные ячейки с серыми крышками). Определение сульфитредуцирующих клостридий возможно также проводить, используя обычные измерительные ячейки (см. примечание).

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 660A и автоклавировать ячейки с внесенной в них питательной средой (крышки должны быть приоткрыты!).

4. Приготовить соответствующие разведения продукта, в котором не допускается наличия сульфитредуцирующих бактерий.

5. Внести 1 мл исследуемого образца в измерительные ячейки сразу после автоклавирования, не дожидаясь снижения температуры (приблизительно 85 -С).

6. Закрыть измерительные ячейки крышками.

7. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

8. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 660A (без инокулята).

9. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения. 10. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac". Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: Образец загрязнен сульфитредуцирующими клостридиями, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М- параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч. На стенках измерительной ячейки должен обнаруживаться выпавший осадок черного цвета.

Примечание. Определение сульфитредуцирующих клостридий возможно также проводить, используя обычные измерительные ячейки и парафиновое масло. Для этого необходимо добавить в каждую измерительную ячейку по 8 мл среды BiMedia 660A и 1 мл парафинового масла (как покрывающий слой) и автоклавировать ячейки с внесенной в них питательной средой и парафиновым маслом (крышки должны быть приоткрыты!). Далее следует выполнить пункты 4 - 10 по основной методике (см. выше).

3.10. Определение Bacillus cereus

1. Среда: модификация селективной среды Мозеля (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 30 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл модифицированной среды Мозеля.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие Bacillus cereus.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл модифицированной среды Мозеля (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки вприбор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IД) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен Bacillus cereus, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру в течение 30 ч.

4. Основные этапы создания калибровочного файла

Для создания калибровочного файла необходимо провести не менее 80 параллельных исследований для одного типа продукции как классическим методом (подсчет КОЕ на чашках Петри), так и автоматическим - с помощью прибора "Бак Трак 4100".

Для этого необходимо:

1. В основном меню программы "Bac Trac" в разделе "Задание пороговых значений" (Thresholds) не указывать пороговые значения (None).

2. Выполнить следующие пункты методики определения мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов:

2.1. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001А.

2.2. Внести 1 мл предварительно подготовленного в соответствии с требованиями нормативной документации исследуемого образца продукта в измерительную ячейку с 9 мл среды.

2.3. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

2.4. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001А (без инокулята).

2.5. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

2.6. После того как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

3. Провести параллельный посев исследуемого продукта на чашки Петри с плотной питательной средой для определения КОЕ в 1 мл жидкого или в 0,1 г твердого продукта.

4. По окончании анализа результат высева (КОЕ в 1 мл жидкого или в 0,1 г твердого продукта), полученный на чашках Петри, занести в соответствующий файл данных программы "Bac Trac". Для этого:

4.1. В основном меню программы "Bac Trac" выбрать раздел "Работа с данными" (Data Functions).

4.2. В меню Data Functions выбрать соответствующие файлы исследования данного продукта в разделе "Выбор файлов" (Select files).

4.3. Внести в меню Data Functions в разделе "Ввод численных значений" (Enter values) результаты КОЕ (в 1 мл жидкого или в 0,1 г твердого продукта) для соответствующих исследованных образцов продуктов.

5. После того как будет получено не менее 80 результатов исследования КОЕ для одного типа продукции двумя параллельными методами - классическим (на чашках Петри) и автоматическим – с помощью прибора "Bac Trac", можно приступать к созданию калибровочного файла для данного типа продукта.

6. Основные этапы создания калибровочного файла:

6.1. В основном меню программы "Bac Trac" выбрать раздел "Работа с данными" (Data Functions).

6.2. В меню Data Functions выбрать соответствующие файлы (не менее 80) исследования данного продукта в разделе "Выбор файлов" (Select files) (данные КОЕ в 1 мл жидкого или в 0,1 г твердого продукта должны быть внесены заранее - см. п. 4).

6.3. В меню Data Functions выбрать раздел "Построение калибровочного файла" (Correlation).

6.4. Указать "Пороговое значение" (Threshold) для М- или Е-параметра, по которому будет проводиться построение калибровочной кривой. Как правило, для построения калибровочной кривой используется М-параметр, численное значение которого 5%.

6.5. После задания порогового значения М-параметра необходимо вычислить корреляцию (Calculate).

6.6. Если коэффициент корреляции превышает (-0,85), то данная калибровочная кривая показывает высокую степень корреляции и отвечает требованиям (рис. 4.1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

6.6.1. Указать "Пороговое значение по времени" (Time-Limits).

Для этого в полученное уравнение регрессии (уравнение калибровочной кривой) необходимо подставить максимально допустимое значение КОЕ (CFU) в 1 мл для жидкого или в 0,1 г для твердого продукта, взятое из соответствующих нормативных документов. Далее следует вычислить логарифм КОЕ (CFU) и определить из уравнения значение времени - (t). Это и есть величина "Порогового значения по времени" (Time-Limits) для данного продукта.

6.6.2. Теперь данная калибровочная кривая может быть записана на диск (Disk) в виде калибровочного файла (Filename).

6.6.3. При необходимости вносится дополнительный комментарий (Comment) для более детального описания калибровочного файла.

6.7. Если коэффициент корреляции не превышает (-0,85), то необходимо более детально проанализировать полученную зависимость. Как правило, прослеживается общая тенденция - большинство точек находится вблизи калибровочной кривой и имеются лишь отдельные "точки-выбросы", которые расположены вдали от калибровочной кривой. В этом случае необходимо "точки-выбросы" исключить. Это приведет к существенному повышению коэффициента корреляции.

7. После создания калибровочного файла необходимо выбрать данный калибровочный файл при задании пороговых значений Thresholds в главном меню программы "Bac Trac" для автоматического подсчета КОЕ.

5. Исследование пищевых продуктов

Исследование пищевых продуктов проводится по микробиологическим показателям, определяемым в соответствии с "Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов" (МЗ СССР, N 5061-89 от 01.08.89), ГОСТами и другими нормативно-техническими документами. Подготовка проб для исследования осуществляется в соответствии с требованиями нормативной документации, регламентирующей данный этап проведения микробиологических анализов пищевых продуктов (ГОСТ 26669-85, 9958-81, 9225-84 и т.д.). 5.1. Мясные продукты

1) мясо замороженное (говядина, телятина, свинина замороженная куском, птица, фарш говяжий); 2) колбасные изделия (колбасы сырокопченые, полукопченые, варено-копченые; колбасы вареные, сосиски, сардельки, хлеба мясные); 3) мясные вареные и запеченные продукты (окороки, говядина прессованная, баранина в форме, бекон прессованный; буженина, ветчина в оболочке, рулеты); 4) готовые мясные изделия (рубленые изделия, студни, паштеты). Определяемые показатели (указаны для всей группы продуктов): 1) мезофильные аэробные и факультативные анаэробные микроорганизмы; 2) бактерии группы кишечных палочек; 3) сальмонелла; 4) сульфитредуцирующие клостридии; 5) staphylococcus aureus; 6) энтерококки. Для автоматического подсчета KOE (CFU) в 1 г можно воспользоваться коммерческим калибровочным файлом MEAT. COR. Микробиологические показатели для данной группы пищевых продуктов определяются по методикам, представленным в гл. 3 данных Указаний.