Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

На правах рукописи

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ И

НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ 2Н (D) И 13С, С

ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ ИЗОТОПНОГО

ОБОГАЩЕНИЯ.

03.00.23-Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕЕ.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н. Ф. МЯСОЕДОВ.

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Б. М. ПОЛАНУЕР.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ "ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК".

Защита диссертации состоялась 24 мая 1996 г в 15.00 на

заседании Диссертационного совета Д 063. 41. 01 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 1S7571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат разослан . апреля 1996 г

Учёный секретарь Диссертационного Совета,
Кандидат химических наук, старший научный сотрудник А. И. ЛЮТИК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием ²Н (D) и углеродом ^|3С, которые незаменимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов. Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы синтезируемые БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD₃OD/D₂O в генетически сконструированных штаммах бактерий. Однако подобные процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D₂O). Явление адаптации к тяжёлой воде интересно не только с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Эти данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllusflagettatum, галофильные бактерии Halobacterium halobium и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Настоящая работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программы "Наукоёмкие химические технологии ".

Целью данной работы была разработка методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода ¹³С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были применены специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных БАС на их основе.

Научная новизна работы заключается в следующих аспектах: