Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2. Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими
выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные ^|3С - аминокислоты (степени изотопноговключения составляют до 97,5%), [1,3',4',2,8-D5]-инозин (степень включения
дейтерия 62,5%) и дейтерий-меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки.

4. Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов
дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Практическая значимость: Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных БАС. В частности, основанных на использовании биологической конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.

На способ получения униформно-меченного дейтерием L-Phe имеется положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства № 055610 от 17.11.1995 г на заявку № 930558240 от 15.12.1993 г. На способ получения [1, 2',4¹,2,8-D5]-инозина оформлена заявка № 95118778 от 14.11.1995 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с униформным характером обогащения клеточных БАС дейтерием. Использование гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтсрий-меченного инозина и бактериородопсина.

2. Методы получения дейтерий- и ¹³С -аминокислот, [1',3',4'D,8-инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СDзОD/¹³СНзОН и тяжёлой воды D₂O.

3. Метод прямой химической модификации препаратов интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном. Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных смесей при данном способе введения метки.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии"(Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й международной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микроорганизмов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на Ci-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано восемь печатных работ и шесть тезисов научных конференций.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.

Бактериальные штаммы и питательные среды.

Исследования проводили с генетически маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:

Штамм №l. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

Штамм №2. - Methylobacillus flagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

Штамм №3. - Bacillus subtilis (his, tyr, ade, иrа), штамм граммотрицательиых бактерий, продуцент инозина.

Штамм №4. - Bacillus amyloliquefacien ade, иrа), штамм грамм отрицательных бактерий, продуцент тимидина.

Штамм №5. - Halobacterium halobium ET 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

В настоящей работе использовали следующие питательные среды.

1. Минимальная среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний.

2. Комплексная ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.

3. Синтетическая среда TS (Gibson Т., 1962). Среду использовали для ферментации штамма №5.

Условия адаптации и культивирования бактерий на дейтерий-содержащих средах.

Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар), с тяжелой водой. При этом использовали как простой рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99,9 ат.% тяжёлой воды, так и многостадийную адаптацию бактерий на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды.

Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на основе тяжёлой воды и дейтерометанола D₂О/СDзОD с использованием безводных реагентов. Полученную таким образом биомассу В. mehylicum гидролизовали в DCI и использовали в качестве источника суммарных химических компонентов для культивирования штаммов №3 и №5 соответственно.

¹³С-аминокислоты были получены за счёт конверсии ¹³СНзОН в метилотрофных бактериях.

Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали селективную синтетическую среду TS, в которой ароматические аминокислоты -L-Phe, L-Tyr и L-Тгр были замещены их дейтерированными аналогами - L-[2,3,4,5,6-Ds]-Phe, L-[3,5-D₂]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D3]-Trp.

Методы выделения и анализа изотопно-меченых БАС.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G.. Dyer W.J, 1959).

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).

Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН): и 6 н. DC1 ( в D₂О)(110°С,24ч).

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).

Дансильные производные аминокислот получали по методу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).

Метиловые эфиры дансил-аминокислот получали по методу Физера (Fiser J., 1963).

Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т.А., 1993).

Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе "Кпаиег" (ФРГ), снабженным УФ-детектором "2563" и интегратором "C-R ЗА" (Shirnadzu, Япония). Неподвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150 х 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Использовали градиентное элюирование растворителями: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил (от 20% В до 100% В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин),

Ионнообменную хроматографию проводили па приборе "Biotronic LC 500!" (ФРГ), 230x3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.

Масс-спектры электронного удара получены на приборе "МВ-80А " (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB были получены на приборе " MBA " (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6-0,8 мА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.