Лабораторная диагностика

10.  Лабораторная диагностика

Для лабораторной диагностики коревой вирусной инфекции практическое применение находят следующие методы: цитологическое исследование окрашенных мазков носового отделяемого; выделение вируса в культуре ткани; исследование сыворотки больного на наличие антител (нейтрализующих, комплементсвязывающих и подавляющих гемагглютинацию).

A.  Цитологическое исследование носового отделяемого.

Исследование проводят следующим образом. При помощи изогнутой стеклянной трубки с резиновым баллончиком собирают слизь из верхних носовых ходов. Материал равномерно наносят на предметное стекло, фиксируют и окрашивают по Папаниколау. Препараты, высушенные на воздухе и окрашенные по Райту, также пригодны для исследования.

Клетки крупные и многоядерные. В ранних случаях они базофильны, с хорошо сохранившимися ядрами. На этой стадии они напоминают слившийся нормальный эпителий. Некоторые синцитиальные скопления сохраняют границы с ресничками или крупными вакуолями, вероятно, принадлежащими мукозным бокаловидным клеткам. Позднее цитоплазма становится эозинофильной или оранжефильной. Ядра окрашиваются более плотно сжимаются. Иногда эти клетки содержат ярко ацидофильные рассеянные цнтоплазматические включения.

В слоях отторгнутого эпителия ядра распределены равномерно, имеют одинаковую форму и размер и не образуют скоплений. Ядра гигантских клеток варьируют в размерах и форме нередко объединены в плотные агрегаты. Гигантские клетки описанного типа не обнаруживаются у больных с инфекциями верхних дыхательных путей, аллергическими состояниями и многими экзантематозными заболеваниями, в частности краснухой, ветряной оспой и скарлатиной.

B.  Выделение вируса в культуре ткани

1. Сбор, хранение и обработка проб.

а. Кровь. Взятие проводят шприцем с 1 мл раствора гепарина (1:2000) и сразу же (или с минимальным интервалом) вносят по 0,1—0,5 мл гепаринизированной крови в 3 пробирки с культурой ткани.

Вирус обычно связан с лейкоцитами, циркулирующими в крови, поэтому вероятность выделения вируса повышается, если заражение проводят не цельной кровью, а суспензией лейкоцитов. Лейкоциты оседают на клеточный слой; культуры инкубируют в неподвижном состоянии 4 дня до первой смены среды. Смену проводят осторожно, чтобы по возможности не переместить лейкоциты. В дальнейшем среду сменяют с недельным интервалом. Культуру периодически просматривают, следя за появлением типичных синцитиальных клеток; они обнаруживаются обычно между 4 и 12 днями культивирования.

б. Глоточное отделяемое. Больного просят прополоскать горло несколькими мл обезжиренного молока, которое затем собирают в стерильный флакон. После добавления пенициллина и стрептомицина (по 500 ЕД/мл) пробу центрифугируют 35 минут при 1500 об/мин и затем вносят по 0,2—0,5 мл в 2—3 культуры клеток.

в. Секрет конъюнктивы. Осторожно протирают конъюнктиву ватным тампоном, который затем обрабатывают, как описано выше.

г. Моча. Пробу собирают в стерильный сосуд, избегая посторонней контаминации. Доводят рН до 7,0—7,2 3% раствором двууглекислого натрия и добавляют пенициллин и стрептомицин (по 200 ЕД/мл). Всю собранную мочу центрифугируют 30 минут при 3000 об/мин и 4°. Осадок ресуспендируют в 1—2 мл культуральной среды и вносят по 0,3 мл в 2—3 пробирки с культурой клеток.

2. Культуры клеток. Для выделения вируса используют только первичные культуры клеток человека или обезьян. Культуры трипсинизированных клеток почек человека, выращенные в наклонном положении, или вертикальные культуры клеток амниона человека имеют преимущество перед культурами клеток обезьян макак резусов и циномольгусов, патас и бабуинов, так как клетки человека обычно не контаминированы спонтанными вирусами.

3. Период наблюдения. В первичных культурах клеток цитопатический эффект проявляется обычно не раньше 5—10-го дня после заражения. Наблюдать культуры нужно не менее 30 дней. Один слепой пассаж может помочь обнаружить вирус при его очень низком исходном титре.

4. Идентификация вируса. Появление многоядерных гигантских клеток и постепенное разрушение клеточного слоя служит указанием на присутствие вируса. Его идентификация включает исследование окрашенных препаратов культуры для обнаружения описанных выше цитологических изменений и реакцию нейтрализации, при постановке которой используют иммунную к вирусу кори и нормальную сыворотки.

C.  Серологическая диагностика

1. Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации можно проводить на белых мышах-сосунках, используя адаптированный штамм вируса.

а. Типы клеточных культур. Для проведения реакции нейтрализации лучше использовать перевиваемые клеточные линии, так как они более чувствительны к адаптированному вирусу кори, чем первичные культуры. Перевиваемые линии клеток человека и обезьян лишь немногим различаются в чувствительности к коревому вирусу. Другие клеточные линии, обладающие равной стабильностью и чувствительностью к вирусу, также пригодны для работы.

б. Выбор вируса. В качестве стандартного штамма можно рекомендовать штамм Edmonston на уровне относительно небольшого числа культуральных пассажей. При использовании других штаммов рекомендуется отбирать те, которые имеют одинаковый инфекционный титр со стандартным вирусом в аналогичных культурах ткани.

в. Выбор рабочей дозы вируса. В реакции нейтрализации используют обычно 100 ТЦД50 вируса, рассчитанных по данным титрования в соответствующей культуре клеток. Результаты титрования варьируют в зависимости от времени учета. Поэтому для используемого типа культур важно определить время, в течение которого цитопатогенность вируса выявляется полностью. В противном случае рабочая доза вируса может быть избыточной, а титры антител в исследуемых сыворотках окажутся неестественно низкими.

г. Титрование суспензии вируса. Основной вирусной суспензией служит жидкая фаза инфицированных культур, которую хранят при —70°. Из основной суспензии готовят разведения на культуральной среде. Каждое разведение вносят в 3—5 пробирок с культурой ткани, помещают их в термостат (37°) и периодически просматривают, следя за появлением цитопатических изменений. Титр рассчитывают по методу Кербера и выражают как lg ТЦД50 в 1 мл или в 0,1 мл.

д. Сыворотки. Берут 5 мл крови, соблюдая предосторожности, чтобы избежать гемолиза, так как сыворотка может потребоваться для реакции связывания комплемента. Кровь оставляют в пробирке до образования сгустка, сыворотку отделяют и инактивируют 30 минут при 56°. Разведения сыворотки готовят на растворе Хэнкса.

Постановка реакции. Для большей точности можно использовать по 5 пробирок культуры на каждое разведение сыворотки. При обычной работе, в частности для определения диагностически значимого подъема титра антител, достаточно 2—3 пробирок. Исходную суспензию вируса разводят культуральной средой до концентрации 100 ТЦД₅₀ в 0,1 мл. Это разведение вируса добавляют в равном объеме к разведениям сыворотки: смеси выдерживают час при 4°, после чего вводят каждую из них в 2—5 пробирок по 0,2 мл и помещают в термостат (37°). Для контроля титра вируса в исходной суспензии готовят три ее разведения, содержащие 100,10 и 1 ТЦД50 в 0,2 мл, заражают каждым из них группу пробирочных культур по 0,2 мл на пробирку и помещают их в термостат вместе с основным опытом. Для контроля чувствительности опыта включают лабораторную стандартную иммунную сыворотку, прошедшую сравнение с эталонной сывороткой.

Интерпретация результатов и их диагностическое значение. При помощи реакции нейтрализации можно получить подтверждение клинического диагноза или установить наличие инфекции в прошлом и невосприимчивость к кори в момент обследования. Для подтверждения диагноза одновременно исследуют сыворотку, взятую в острой фазе болезни, и сыворотку, полученную в стадии реконвалесценции. Появление антител или 4-кратное (и выше) нарастание их титра рассматривают как подтверждение коревой инфекции. Обнаружение вируснейтрализующих антител в любом титре можно считать подтверждением прошлой инфекции, а также невосприимчивости к заражению в период исследования. Наблюдения показывают, что лица даже со следами антител не заболевают при контакте с больными. В нормальном организме инфекция вирусом кори, как правило, вызывает быстрое образование антител.