Реакция связывания комплемента

2. Реакция связывания комплемента.

Методы проведения реакции при кори не отличаются существенно от применяемых с другими вирусными антигенами. Реакция дает вполне удовлетворительные и воспроизводимые результаты при постановке в пробирках, микрообъемах или капельным методом.

а. Приготовление антигена. Антигены можно готовить на многих типах клеточных культур — первичных культурах клеток почек человека, обезьян (резус и циномольгус) и собак, перевиваемых линиях клеток приматов. В качестве источника для получения антигена обычно используют жидкую фазу инфицированных культур или смесь ее с экстрактом инфицированных клеток. Антиген накапливается медленно, поэтому культуры следует тщательно поддерживать некоторое время после широкого распространения цитопатического эффекта в клеточном слое.

Обычно рабочим правилом является проведение сбора материала для антигена не ранее 7 дней после основательного развития цитопатического эффекта. Чтобы увеличить выработку антигена, культуры заражают максимально возможной дозой вируса. Некоторое повышение титра антигена достигают 3-кратным попеременным замораживанием и оттаиванием культур перед сбором жидкости в смеси сухого льда и спирта. Это способствует освобождению вирусного антигена из клеток. Собранный и смешанный материал прогревают 30 минут при 56° для инактивации вируса и центрифугируют 15 минут при 2000 об/мин. На-досадочную жидкость (антиген) разливают в плотно закрывающиеся флакончики. При —15° антиген можно хранить в течение многих месяцев.

б. Сыворотки. Сыворотки людей инактивируют 30 минут при 56° исразу же исследуют или хранят при 15°-20°. Сыворотки обезьян могут приобретать некоторую степень антикомплементарности.

в. Техника реакции связывания комплемента при кори.

Стандартный метод проведения реакции связывания комплемента в пробирках является модификацией метода Колмера. Используют 2 единицы комплемента, связывание проводят при 5° в течение 16—18 часов. Антигены и сыворотки берут в объемах по 0,25 мл, комплемент и взвесь сенсибилизированных эритроцитов — по 0,5 мл. Антиген готовят из штамма Edmonston на относительно низком пассажном уровне, выращивание проводят на перевиваемых клетках FL амниона человека. Титр антигена соответствует наибольшему разведению, связывающему комплемент в присутствии 4 единиц антител, и составляет обычно 1:4. Титр антител соответствует наибольшему из двукратных разведений сыворотки, дающему связывание на 4+ или 3+.

3. Реакция торможения гемагглютинации.

а. Приготовление гемагглютинина. Клеточные культуры, пригодные для получения гемагглютинина вируса кори, включают перевиваемые линии клеток KB, клеток Lu 106—легкого эмбриона человека, первичные культуры почечных клеток обезьян бабуинов, почечных клеток собак и ряд других перевиваемых линий и первичных культур. Выработка гемагглютинина в клетках почек собак протекает медленнее, чем в клетках перевиваемых линий, однако его конечные концентрации вполне сравнимы с получаемыми в других типах культур, а иногда оказываются более высокими. Согласно имеющимся данным, высокие инфекционные титры соответствуют тем клеточным системам, где размножение вируса достигает наибольших уровней.

В период выработки гемагглютинина применяют разнообразные поддерживающие среды. Для клеток KB пригодна среда 199 с 5% куриной или телячьей сыворотки; для культур ткани почек собак — среда с коровьей амниотической жидкостью или среда, состоящая из 0,5% гидролизата лактальбумина и 2% инактивированной телячьей сыворотки в растворе Эрла.

Культуры заражают неразведенной вирусной суспензией высокого титра и инкубируют в термостате до тех пор, пока цитопатический эффект не проявится в 50—100% клеток. После этого культуры трижды попеременно замораживают и оттаивают, смешивают полученную жидкость и удаляют взвешенные частицы центрифугированием 20 минут ар и 1500 об/мин.

Гемагглютинационный титр такого препарата обычно низок, поэтому проводят дополнительную концентрацию антигена. Один из применяемых методов концентрации заключается в добавлении к жидкости 0,06% желатина, центрифугировании 90 минут при 30000 об/мин, удалении 9/10 надосадочной жидкости и ресуспендировании осадка в оставшейся 1/10.

Метод, предложенный Norrby, позволяет получить гемагглютинин достаточно высоких титров, пригодный для практического использования без дополнительной концентрации. Культуры перевиваемых клеток легкого эмбриона человека (линия Lu 106) или первичные культуры клеток собачьих почек заражают неразведенным вирусом (штамм Edmonston) и инкубируют при 33°. Среду сменяют через 2—3 дня. Когда все (или почти все) клетки окажутся пораженными, культуры подвергают троекратному попеременному замораживанию и оттаиванию и собирают культуральную жидкость. Добавляют Твин 80 в концентрации 0,125% при постоянном помешивании на холоде (можно при комнатной температуре). Затем на холоде при постоянном помешивании добавляют эфир (половину объема обрабатываемого материала) и продолжают перемешивание 15 минут. Центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин, отбирают водную фазу и удаляют из нее остатки эфира пропусканием газообразного азота. Такая обработка препаратов, полученных на клетках Lu 106, увеличивает титр гемагглютинина в 4—8 раз, а полученных на клетках почек собак-в 8-32 раза. Без добавления Твина 80 обработка эфиром снижает титр гемагглютинина.

б. Сыворотки. Проводят инактивацию сывороток 30 минут при 56°. Так как некоторые сыворотки человека и различных животных (например, кроликов) содержат агглютинины к эритроцитам обезьян, рекомендуется провести адсорбцию каждой сыворотки при 4° в течение ночи с равным объемом 50% взвеси обезьяньих эритроцитов, которые затем удаляют центрифугированием или осторожным отсасыванием отстоявшейся за ночь сыворотки.

в. Эритроциты. Подходящими для реакции являются эритроциты бабуинов, макак резусов, обезьян патас и зеленых мартышек. Кровь собирают и хранят в растворе Алсивера. Перед употреблением эритроциты отмывают трижды в физиологическом растворе. В опыте используют 0,5% взвесь эритроцитов в физиологическом растворе.

г. Титрование гемагглютинина. Для титрования можно использовать пробирки или пластмассовые пластины с лунками. При титровании в пробирках приготавливают двукратные разведения антигена в фосфатно-буферном солевом растворе при рН 7,2. К 0,4 мл каждого разведения добавляют 0,2 мл 0,5% суспензии эритроцитов в том же растворе. Пробирки встряхивают и выдерживают час при 38°. Оценку гемагглютннации проводят, как при работе с другими гемагглютинирующими вирусами. Наибольшее разведение антигена, вызывающее полную или частичную агглютинацию, считают содержащим 1 гемагглютинирующую единицу. При использовании пластмассовых пластин техника идентична, но объем каждого из ингредиентов, вносимых в лунку, снижают до 0,2 мл; в качестве разбавителя можно использовать физиологический раствор.

Проведение опыта. При проведении реакции в пробирках все ингредиенты разводят фосфатно-буферным солевым раствором. К 0,2 мл каждого разведения сыворотки добавляют 4 единицы гемагглютинина в объеме 0,2 мл. Смеси выдерживают час при комнатной температуре и добавляют в каждую пробирку 0,2 мл 0,5% взвеси обезьяньих эритроцитов. Пробирки встряхивают и выдерживают 30—60 минут при 37° до полного формирования осадка. Титры соответствуют наибольшим разведениям сывороток, вызвавшим полное торможение гемагглютинацин. При использовании пластмассовых пластин техника идентична, но объемы каждого из ингредиентов снижают до 0,1 мл, а концентрацию эритроцитов во взвеси доводят до 1%. В качестве разбавителя можно использовать физиологический раствор.

Интерпретация результатов. При исследовании двух проб сыворотки-ранней и реконвалесцентной—нарастание титра антител в 4 раза и выше рассматривают как результат, согласующийся с диагнозом кори. Обнаружение специфических антигемагглютининов к вирусу кори в единичной пробе сыворотки рассматривают как указание на инфекцию в прошлом и на наличие невосприимчивости к кори в период исследования. Отсутствие антигемагглютинина, в частности в низком разведении сыворотки (1:2), свидетельствует обычно о восприимчивости к коревой инфекции.

11.  Лечение

Симптоматическое, в случае развития пневмонии или других бактериальных осложнений показаны антибиотики, в тяжелых случаях крупа используются кортикостероиды. Рибавирин показал свою эффективность in vitro. Для профилактики и лечения могут использоваться большие дозы витамина А.