МЕТОДЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

1.1.2 МЕТОДЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Фармацевтический анализ — основа фармацевтической химии. Это — наука о химической характеристике и измерении БАВ на всех этапах производства (от контроля сырья до оценки качества полученных лекарств), изучения их стабильности, установления срока годности и стандартизации готовой лекарственной формы. Фармацевтический анализ имеет свои особенности, отличающие его от других видов анализа. Они заключаются в том, что анализу подвергают вещества различной химической природы: неорганические, элементоорганические, радиоактивные, органические соединения от простых алифатических до сложных природных БАВ. Чрезвычайно широк диапазон концентраций анализируемых веществ. Объектами фармацевтического анализа являются не только индивидуальные лекарственные вещества, но и смеси, содержащие различное число компонентов.

Ежегодное пополнение арсенала лекарственных средств вызывает необходимость разработки новых способов их анализа. Способы фармацевтического анализа нуждаются в систематическом совершенствовании и в связи с непрерывным повышением требований к качеству лекарственных средств, причем растут требования как к степени чистоты лекарств, так и к количественному содержанию в них БАВ. Вот почему к фармацевтическому анализу предъявляют высокие требования. Он должен быть достаточно специфичен и чувствителен, точен по отношению к нормативным требованиям ГФ X и XI и другой НТД (ФС, ВФС), выполняться в короткие промежутки времени с использованием минимальных количеств испытуемых препаратов и реактивов.

В зависимости от поставленных задач фармацевтический анализ включает различные формы контроля качества лекарств: фармакопейный анализ; постадийный контроль производства лекарственных средств; анализ лекарственных форм индивидуального приготовления; экс пресс-анализ в условиях аптеки и биофармацевтический анализ. Составной его частью является фармакопейный анализ, который представляет собой совокупность способов исследований лекарственных препаратов и лекарственных форм, изложенных в ГФ или другой НТД (ВФС, ФС). На основании результатов, полученных при выполнении фармакопейного анализа, делается заключение о соответствии лекарственного средства требованиям ГФ или другой НТД. При отклонении от этих требований лекарство не допускается к применению.

Заключение о качестве лекарственного средства делают на основании анализа пробы (выборки). Порядок ее отбора указан либо в частной статье, либо в общей статье ГФ XI (вып. 2), либо в соответствии с требованиями, изложенными в частных статьях или инструкциях по контролю, утвержденных МЗ РФ или Департамента ветеринарии РФ. Отбор проб производится только из неповрежденных укупоренных и упакованных в соответствии с требованиями НТД упаковочных единиц. При этом необходимо строго соблюдать особые меры предосторожности при работе с наркотическими и ядовитыми лекарственными средствами, а также с токсичными, огнеопасными, взрывоопасными, гигроскопичными и другими лекарствами. Для испытания на соответствие требованиям НТД проводят многоступенчатый отбор проб. Число ступеней определяется видом упаковки. На последней ступени (после контроля по внешнему виду) берут пробу в количестве, необходимом для четырех полных физико-химических анализов (если пробу отбирают для контролирующих организаций, то на шесть таких анализов).

Из расфасовки «ангро» берут точные пробы, взятые в равных количествах из верхнего, среднего и нижнего слоев в каждой упаковочной единице. После установления однородности все эти пробы смешивают. Сыпучие и вязкие лекарственные средства отбирают пробоотборником, изготовленным из инертного материала. Жидкие лекарственные формы перед отбором проб тщательно перемешивают. Если это сделать затруднительно, то отбирают точечные пробы из разных слоев. Отбор выборок готовых лекарственных средств осуществляют в соответствии с требованиями НТД.

Фармакопейный анализ позволяет установить подлинность лекарственного средства, его чистоту, определить количественное содержание фармакологически активного вещества или ингредиентов, входящих в состав лекарственных форм. И несмотря на то что каждый из этих этапов имеет свою конкретную цель, их нельзя рассматривать изолированно. Они взаимосвязаны и взаимно дополняют друг друга. Так, например, температура плавления, растворимость, рН среды водного раствора и т. д. являются критериями как подлинности, так и чистоты лекарственного вещества.

Для обобщения большого объема частных сведений по фармакопейному анализу, изложенному в ФС (ВФС) и технических условиях (ТУ), целесообразно рассмотреть основные критерии фармацевтического анализа и общие принципы испытаний на подлинность, чистоту и количественное определение лекарственных веществ.

Критерии фармацевтического анализа. В зависимости от поставленных задач на различных этапах фармацевтического анализа имеют значение такие критерии, как избирательность, чувствительность, точность, время, затраченное на выполнение анализа, израсходованное количество анализируемого препарата (лекарственной формы) и реактивов.

Избирательность метода очень важна при проведении анализа смесей веществ, так как дает возможность получать истинные значения каждого из компонентов. Только избирательные методики анализа позволяют определять содержание основного компонента в присутствии продуктов разложения и других примесей.

Точность и чувствительность анализа зависят от объекта и цели исследования. При испытании степени чистоты препарата используют методики, отличающиеся высокой чувствительностью, позволяющие устанавливать минимальное содержание примесей.

Фактор времени играет важную роль при выполнении постадийного контроля производства и при проведении экспресс-анализа в аптеке.

Мерой чувствительности реакций является предел обнаружен и я. Он означает наименьшее содержание, при котором по данной методике можно обнаружить присутствие определяемого компрнента с заданной доверительной вероятностью. Термин «предел обнаружения» учрежден вместо понятия — открываемый минимум. Им пользуются также взамен термина «чувствительность». На предел обнаружения влияют такие факторы, как объем растворов реагирующих компонентов, концентрация реактивов, рН среды, температура, продолжительность опыта. Это следует учитывать при разработке методик качественного фармацевтического анализа.

Для установления чувствительности реакций все шире используют показатель поглощения (удельный или молярный), устанавливаемый спектрофотометрическим методом. В химическом анализе чувствительность устанавливают по величине предела обнаружения данной реакции.

Высокой чувствительностью отличаются физико-химические методы анализа. Наиболее высокочувствительны радиохимические и масс-спектральный методы, позволяющие определить 10-⁸—10~⁹ % анализируемого вещества, а также полярографические и флуориметрические — Ю~⁶—10"⁹ %. Чувствительность спектрофотометрических методов — 10~³— Ю^ь% , потенциометрических — 10*²%.

Точность анализа включает одновременно два понятия — воспроизводимость и правильность полученных результатов: воспроизводимость характеризует рассеивание результатов анализа по сравнению со средним значением; правильность отражает разность между действительным и найденным содержанием вещества. Точность анализа у каждого метода различна и зависит от многих факторов: калибровки измерительных приборов, точности отвешивания или отмеривания, опытности аналитика и т. д. Точность результата анализа не может быть выше, чем точность наименее точного измерения. Так, при вычислении результатов титриметрических определений наименее точная цифра — количество миллилитров титрата, израсходованного на титрование.

В современных бюретках в зависимости от класса их точности максимальная ошибка отмеривания около ±0,02 мл. Ошибка от натекания тоже равна ±0,02 мл. Если при указанной общей ошибке отмеривания и натекания ±0,04 мл на титрование расходуется 20 мл титрата, то относительная ошибка составит 0,2 %. При уменьшении навески и количества миллилитров титрата точность соответствия уменьшается. Таким образом, титриметрическое определение можно выполнять с относительной погрешностью ±(0,2—0,3%). Точность титриметрических определений можно повысить, если пользоваться микробюретками, применение которых значительно уменьшает ошибки от неточного отмеривания, натекания и влияния температуры. Погрешность допускается только при взятии навески.

Получение навески при выполнении анализа лекарственного вещества осуществляют с точностью до 0,2 мг. При взятии обычной для фармакопейного анализа навески препарата 0,5 г и точности взвешивания ±0,2 мг относительная ошибка будет равна 0,4 %. При выполнении экспресс-анализа лекарственных форм такая точность не требуется, поэтому навеску берут с точностью ±(0,001—0,01 г), т. е. с определенной относительной ошибкой 0,1—1 %. Это можно отнести и к навеске для колориметрического анализа, точность которой ±5 %.

При выполнении количественного анализа любым физическим или физико-химическим методом могут быть допущены три вида ошибок: грубые (промахи), систематические (определенные) и случайные (неопределенные).

Грубые ошибки— результат просчета наблюдателя при выполнении какой-либо из операций определения или неправильно выполненных расчетов. Результаты с грубыми ошибками отбрасываются как недоброкачественные.

Систематические ошибки отражают правильность результатов анализа. Они искажают результаты измерений обычно в одну сторону (положительную или отрицательную) на некоторое постоянное значение. Причиной систематических ошибок в анализе могут быть, например, гигроскопичность препарата при отвешивании его навески, несовершенство измерительных и физико-химических приборов, недостаточная опытность аналитика и др. Систематическую ошибку можно частично устранить внесением поправок так, чтобы она была соизмерима с ошибкой прибора и не превышала случайной ошибки.

Случайные ошибки отражают воспроизводимость результатов анализа. Они называются неконтролируемыми переменными.

Среднее арифметическое случайных ошибок стремится к нулю при постановке большого числа опытов в одних и тех же условиях. Поэтому для расчета необходимо использовать не результаты единичных измерений, а средние из нескольких параллельных определений.

Правильность результатов определений выражают абсолютной и относительной ошибкой.

Абсолютная ошибка представляет собой разность между полученным результатом и истинным значением. Эта ошибка выражается в тех же единицах, что и определяемая величина (граммах, миллилитрах, процентах).

Относительная ошибка определения равна отношению абсолютной ошибки к истинному значению определяемой величины. Выражают относительную ошибку обычно в процентах (умножая полученную величину на 100). Относительные ошибки определений физико-химическими методами включают как точность выполнения подготовительных операций (взвешивания, отмеривания, растворения), так и точность выполнения измерений на приборе (инструментальная ошибка). Значения относительных ошибок находятся в зависимости от того, каким методом выполняется анализ и что собой представляет анализируемый объект — индивидуальное вещество или многокомпонентная смесь. Индивидуальные вещества можно определять при анализе спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовых и видимых областях с относительной погрешностью ±(3—3,5) %, полярографией ±(2—3) % , потенциометрией ±(0,3—1) %.

При анализе многокомпонентных смесей относительная погрешность определения этими методами возрастает примерно в 2 раза. Сочетание хроматографии с другими методами, в частности использование хроматооптических и хроматоэлектрохимических методов, позволяет выполнять анализ многокомпонентных смесей с относительной погрешностью ±(3—7) %.

Точность биологических методов намного ниже, чем химических и физико-химических. Относительная ошибка биологических определений достигает 20—30 % и даже 50 %. Для повышения точности в ГФ XI введен статистический анализ результатов биологических испытаний.

В то же время относительная ошибка может быть уменьшена за счет увеличения числа параллельных измерений. Однако эти возможности имеют определенный предел. Уменьшать случайную ошибку измерений, увеличивая число опытов, целесообразно до тех пор, пока она станет меньше систематической. Обычно в фармацевтическом анализе выполняют 3—6 параллельных измерений. При статистической обработке результатов определений с целью получения достоверных результатов выполняют не менее семи параллельных измерений.

Общие принципы испытаний подлинности лекарственных веществ. Испытание на подлинность — это подтверждение идентичности анализируемого лекарственного вещества (лекарственной формы), осуществляемое на основе требований ГФ или другой НТД. Испытания выполняют физическими, химическими или физико-химическими методами. Непременное условие объективного испытания подлинности лекарственного вещества — идентификация тех ионов и функциональных групп, входящих в структуру молекул, которые обусловливают фармакологическую активность. С помощью физических и химических констант (удельного _N вращения, рН среды, показателя преломления, УФ и ИК спектра) подтверждают и другие свойства молекул, оказывающие фармакологическое влияние. Применяемые в фармацевтическом анализе химические реакции сопровождаются образованием окрашенных соединений, выделением газообразных или нерастворимых в воде соединений. Последние можно идентифицировать по температуре плавления.

Физические методы установления подлинности. Они основаны на выявлении физических свойств путем измерений физических констант лекарственных веществ. Подлинность подтверждают: агрегатное состояние (твердое вещество, жидкость, газ); окраска, запах, форма кристаллов или аморфность вещества; гигроскопичность или степень выветриваемости на воздухе; устойчивость к воздействию света, кислорода воздуха; летучесть, подвижность, воспламеняемость. При этом более объективным является установление различных физических констант: температуры плавления (разложения), темпера- туры затвердевания или кипения, плотности, вязкости, растворимости в воде, кислотах, щелочах, органических растворителях (эфире, хлороформе, ацетоне, бензоле, этиловом и метиловом спиртах, маслах и др.).

Температура плавления является постоянной величиной для индивидуального вещества. Присутствие примесей изменяет эту константу (чаще снижает), что позволяет судить о степени чистоты. Подтвердить индивидуальность исследуемого вещества можно пробой смешанного плавления, так как смесь двух веществ, имеющих одинаковые температуры плавления плавится при одной температуре. Для установления температуры плавления ГФ XI рекомендует капиллярный метод, при этом подразумевается интервал температур, при котором происходит процесс плавления препарата, от появления первых капель жидкости до полного перехода вещества в жидкое состояние. Интервал температур плавления между началом и окончанием плавления не должен превышать 2 "С. Если он выше, то в частной статье должно быть указано, на какую величину. Если переход вещества из твердого состояния в жидкое нечеткий, то вместо интервала температуры плавления устанавливают температуру, при которой происходит только начало или окончание плавления. Для этих исследований используют специальные приборы и методики, например прибор, описанный в ГФ XI, вып. 1, с. 16.

Под температурой затвердевания понимают наиболее высокую, остающуюся в течение короткого времени постоянную температуру, при которой происходит переход вещества из жидкого состояния в твердое. В ГФ XI, вып. 1, с. 20 описано устройство прибора и методика его применения.

Температура кипения, или, точнее, температурные пределы перегонки, — это интервал между начальной и конечной температурой кипения при нормальном давлении 760 мм рт. ст. Температура, при которой в приемник перегнались первые 5 капель жидкости, называют начальной температурой кипения, а температуру, при которой перешло в приемник 95% жидкости, — конечной температурой кипения. В ГФ XI, вып. 1, с. 17 рекомендован прибор для этих целей.

При установлении плотности берут массу вещества определенного объема и устанавливают ее с помощью пикнометра или ареометра (ГФ XI, вып. 1, с. 24—26), строго соблюдая температурный режим. Обычно это достигается термостатированием пикнометра при 20 "С. Определенные интервалы значений плотности подтверждают подлинность этилового спирта, глицерина, масла вазелинового, вазелина, парафина твердого, галогенопроизводных углеводородов (хлор-этила, фторотана, хлороформа), раствора формальдегида, эфира для наркоза, амилнитрита и др. ГФ XI, вып. 1, с. 26 рекомендует устанавливать содержание спирта этилового в его препаратах 95, 90, 70 и 40 %-ной плотности, а в лекарственных формах либо дистилляцией с последующим установлением плотности, либо по температуре кипения водно-спиртовых растворов (в том числе настоек). Дистилляцию осуществляют кипячением определенных количеств спиртоводных смесей (настоек) в колбах, герметически соединенных с приемником. Последний представляет собой мерную колбу вместимостью 50 мл. Собирают 48 мл отгона, доводят его температуру до 20 "С и добавляют водой до метки, после чего устанавливают плотность отгона пикнометром.

Определение спирта (в настойках) по температуре кипения изложено в ГФ XI, вып. 1, с. 27—28, вместе с таблицей, по которой вычисляют концентрацию.

Вязкость (внутреннее трение) подтверждает подлинность жидких лекарственных средств. Различают динамическую (абсолютную), кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкости. Каждая из них имеет свои единицы измерения. Например, для оценки качества жидких препаратов, имеющих вязкую консистенцию (глицерина, вазелина, масел) обычно определяют относительную вязкость. Она представляет собой отношение вязкости исследуемой жидкости к вязкости воды, принятой за единицу. Для измерения кинематической вязкости используют различные модификации вискозиметров типа Оствальда и Уббелоди. Эту вязкость выражают в м²-с~'. Зная плотность исследуемой жидкости, можно затем вычислить динамическую вязкость, которую выражают в Пас. Динамическую вязкость можно также установить с помощью ротационных вискозиметров различной модификации типа «полимер РПЭ-1» или микрореометров серии ВИР. Имеются и другие приборы. Все они должны термостатироваться.

Растворимость согласно ГФ XI может служить ориентировочной характеристикой испытуемого препарата. Наряду с температурой плавления растворимость веществ при постоянных температуре и давлении является одним из параметров, по которому устанавливают подлинность и чистоту практически всех лекарственных веществ. В ГФ XI, вып. 1, с. 176 приняты условные термины, обозначающие растворимость.

Определение растворимости по методике ГФ XI основано на том, что навеску предварительно растертого (в необходимых случаях) препарата вносят в отмеренный объем растворителя и непрерывно перемешивают в течение 10 мин при 20+2 °С. Растворившимся считается препарат, в растворе которого в проходящем свете не видно частиц вещества. Если для растворения препарата требуется более 10 мин, то его относят к числу медленно растворимых. В этом случае смесь с растворителем нагревают на водяной бане до 30 °С и наблюдают полноту растворения после охлаждения до 20 "С и энергично встряхивают в течение 1—2 мин. Показатели растворимости в различных растворителях указываются в частных статьях, в которых оговариваются случаи, когда растворимость подтверждает степень чистоты лекарственного вещества.

Имеется метод фазовой растворимости (ГФ XI, вып. 1, с. 149), который дает возможность осуществить количественную оценку степени чистоты лекарственного вещества путем точных измерений значений растворимости. Метод основан на правиле фаз Гибса, которое устанавливает зависимость между числом фаз и числом компонентов в условиях равновесия. Суть установления фазовой растворимости заключается в последовательном прибавлении увеличивающейся массы препарата к постоянному объему растворителя. Для достижения состояния равновесия смесь длительно встряхивают при постоянной температуре, а затем с помощью диаграмм определяют, является ли испытуемый препарат индивидуальным веществом или смесью. Этот метод можно использовать для качественного и количественного анализов, а также для изучения стабильности и получения очищенных образцов препарата (до степени чистоты 99,5% ). Одно из важных достоинств метода — возможность отличать оптические изомеры и полиморфные варианты лекарственных веществ. Метод применим ко всем видам соединений, которые образуют истинные растворы.

Химические методы установления подлинности. Идентификация неорганических лекарственных веществ —это установление их подлинности, основанное на обнаружении с помощью химических реакций катионов и аминов, входящих в состав их молекул.

Реакции осаждения анионов и катионов используют для обнаружения наибольшего числа катионов и анионов, входящих в состав молекул вещества. Образующиеся нерастворимые в воде вещества могут быть охарактеризованы по окраске, растворимости (в кислотах, щелочах, органических растворителях), способности образовывать растворимые в избытке реактивов комплексные соединения и т. д.

Реакции осаждения используют для идентификации ионов натрия (с цинкураниллацитатом) и ионов калия (с винной кислотой). Ион калия можно также обнаружить, используя в качестве реактива тетрафенилборат натрия. В нейтральной и щелочной среде он образует белый осадок тетрафенилбората калия. Процесс происходит количественно, в том числе в присутствии ионов натрия, лития, ряда анионов. Ион аммония, органические аммониевые основания (включая алкалоиды) образуют осадки в тех же условиях. Соли натрия, растворимые в воде, образуют белый кристаллический осадок с раствором карбоната натрия, а с раствором фосфата натрия — желеобразный осадок фосфата лития. Ион кальция обнаруживают по образованию белого осадка с раствором оксалата аммония. В свою очередь, ион кальция применяют как реактив на обнаружение цитрат-ионов.

По образованию окрашенных или белых осадков сульфидов испытывают подлинность препаратов ртути (черный), цинка (белый), висмута (коричнево-черный), мышьяка (ярко-желтый). Из растворов солей висмута в серной кислоте после добавления йодида выпадает черный осадок, растворимый в избытке реактива с образованием раствора желто-оранжевого цвета. После добавления к образовавшемуся комплексу нескольких объемов воды и нагревания вновь образуется осадок оранжевого цвета.

Реакциями осаждения гидроксидом аммония подтверждают подлинность катионов цинка, меди, серебра. Полученные белые осадки гидроксидов растворяют в избытке раствора аммиака вследствие образования водорастворимых комплексных солей. Подобный метод применяют для идентификации солей ртути, растворы которых с эквимолекулярным количеством йодида калия образуют красный осадок дийодида ртути. Последний в избытке йодида калия превращается в бесцветный раствор комплексной соли. Растворимые соли ртути с раствором гидроксида натрия образуют желтый осадок гидроксида ртути.

Гексацианоферрат калия — реактив на ион железа (синий осадок) и на ион цинка (белый осадок).

Некоторые реакции осаждения применяют для испытания подлинности обоих реагирующих ионов. Так, ион калия используют как реактив на тартрат-ион, а взаимодействие иона бария с сульфат-ионом — для идентификации как катиона, так и аниона. Сульфат бария практически нерастворим в воде, растворах кислот и щелочей. Аналогичную реакцию осаждения с растворами солей бария дают сульфиты. Однако образующийся белый осадок сульфита бария, в отличие от его сульфата, растворяется в разведенной соляной кислоте. Сульфат-ионы можно также обнаружить с помощью раствора ацетата свинца (белый осадок сульфата свинца). Осадок растворим в концентрированной серной кислоте и в растворах едких щелочей (гидроксидов).

Хлориды, бромиды, йодиды обнаруживают, используя в качестве реактива раствор нитрата серебра, а ион серебра — по реакции с хлоридами. При испытании бромидов (гидробромидов) и хлоридов (гидрохлоридов) — нерастворимых и малорастворимых оснований — сначала взбалтывают их с раствором аммиака и фильтруют. Затем фильтрат подкисляют азотной кислотой и выполняют реакцию с раствором нитрата серебра.

Растворы карбонатов при добавлении насыщенного раствора сульфата магния образуют белый осадок. Гидрокарбонаты дают эту реакцию только после кипячения смеси.

Растворы фосфатов, имеющие рН около 7,0, с раствором нитрата серебра образуют желтый осадок. Фосфаты, растворенные в разведенной азотной кислоте, с раствором молибдата аммония образуют желтый кристаллический осадок фосфор-молибдата аммония. Реакцию образования белого осадка фосфата магния-аммония используют для обнаружения катиона магния и фосфат-ионов. Подобную реакцию образования осадка арсената магния-аммония используют для обнаружения арсената йода. В качестве реактива на арсенит- и арсенат-ионы используют раствор ионного серебра (образуется соответственно желтый или шоколадного цвета осадок).

Тиосульфат-ион в этих условиях дает белый осадок, который затем желтеет, буреет и становится черным.

Окислительно-восстановительные реакции. Реакции восстановления металлов из оксидов или солей используют для испытания подлинности препаратов серебра, меди.

Окислительные свойства галогенов (хлора) используют для идентификации бромидов и йодидов и, наоборот, для обнаружения свободного хлора. Выделившийся бром окрашивает хлороформный слой в оранжевый цвет, а йод — в фиолетовый. Для йода специфична реакция с крахмалом (синий цвет).

Соли ионов железа образуют с тиоцианатом аммония окрашенное в красный цвет комплексное соединение — тиоцианат железа, состав которого в зависимости от концентрации реагирующих компонентов колеблется от [Fe (NCS)]²⁺ до [Fe(NCS)₆]³~.

Реакция окисления дифениламина лежит в основе испытаний подлинности нитратов и нитритов. Дифениламин восстанавливает нитраты (нитриты), окисляясь до дифенилбензидина, а затем до хи-ноидного соединения (синий цвет). Нитраты, в отличие от нитритов, не обесцвечивают раствор перманганата калия в разведенной серной кислоте. Обнаружить нитраты можно с помощью нитробензола в присутствии концентрированной серной кислоты. Смесь охлаждают во льду, перемешивают, добавляют воду и раствор гидроксида натрия. После добавления ацетона, встряхивания и разделения слоев в верхней фазе появляется фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием псевдонитрокислот в щелочной среде.

Йодиды при нагревании с концентрированной серной кислотой выделяют фиолетовые пары йода. Перманганат-ион обесцвечивается от действия восстановителей [лактаты, пероксид водорода, сульфат железа (II)].

Реакции нейтрализации и разложения анионов. Карбонаты и гидрокарбонаты под действием минеральных кислот образуют газообразный гидроксид углерода.

Соли аммония под действием едких щелочей (гидроксидов) выделяют аммиак, который обнаруживают по запаху или по изменению окраски лакмусовой бумаги.

Сульфаты под действием минеральных кислот разлагаются на воду и диоксид серы, имеющий характерный резкий запах.

Нитриты под действием кислот выделяют оксиды азота (диоксид азота имеет красно-бурую окраску).

Тиосульфат-ион под действием разбавленной соляной кислоты выделяет диоксид серы и мелкодисперсный желтый осадок (сера).

Изменение окраски бесцветного пламени. Соли натрия при внесении в бесцветное пламя горелки окрашивают его в желтый цвет, калия — в фиолетовый, кальция — в кирпично-красный, лития — в карминно-красный. Препараты бора (растворенные в этиловом спирте) горят пламенем, окаймленным зеленым ободком. Зги испытания позволяют обнаруживать указанные элементы в неорганических и элементоорганических лекарственных веществах.

Изменения, происходящие при нагревании и прокаливании препаратов. Йод кристаллический, препараты мышьяка и ртути возгоняются и сублимируются (испытания выполнять под тягой!), цинка оксид при прокаливании желтеет. Висмута нитрат основной разлагается с образованием желтого остатка (оксид висмута) и желто-бурых паров (диоксид азота).

Идентификация элементоорганических лекарственных веществ. Элементный анализ используют для испытания веществ, содержащих в молекуле атомы серы, фосфора, галогенов, мышьяка, висмута, ртути и др. Поскольку атомы этих элементов в данных лекарственных веществах не ионизированы, необходимым условием испытания их подлинности является предварительная минерализация. В результате происходит разрушение органической части молекулы (превращение углерода, водорода и кислорода в диоксид углерода и воду), а атомы серы, фосфора, галогенов, мышьяка, висмута, ртути образуют соответствующие ионы. Последние затем идентифицируют с помощью рассмотренных осадочных реакций на неорганические ионы.

Для обнаружения серы используют две реакции: одна основана на восстановлении серы до сульфид-иона, другая — на окислении до сульфат-иона. Процесс восстановления тиоэфирной и тиокетонной серы из препаратов (норсульфазол, фталозол, этазол, тиофосфамид, тиамин и др.) осуществляют нагреванием с 10%-ным раствором гид-роксида натрия. Образовавшийся сульфид затем обнаруживают реакцией с нитропруссидом натрия (красно-фиолетовое окрашивание), с помощью солей свинца (черное окрашивание) или по выделению сероводорода после добавления кислоты. Этим способом обнаруживают тиоэфирные и тиокетонные связи серы в растительных объектах, аминокислотах, белковых веществах и эфирных маслах.

Серу, содержащуюся в молекулах производных сульфокислот, сульфаниламидных препаратов, метансульфат-ионе, можно обнаружить озолением, окислением (концентрированной азотной кислотой) или сплавлением со смесью нитрата и карбоната калия. Происходит образование сульфат-иона, который обнаруживают реакцией с растворимыми солями бария. Способ, основанный на разрушении органической части молекулы путем спекания, можно использовать и для обнаружения хлора, например в галогенопроизводных алкилуреидов сульфакислот (хлорпропамид). Образовавшиеся сульфат-хлорид-ионы открывают обычными аналитическими реакциями. Аналогичный способ используют для обнаружения кобальта (в цианкобаламине) после спекания с гидросульфитом калия.

Галогены в элементоорганических соединениях можно обнаружить, используя восстановительную минерализацию. Процесс восстановления может быть выполнен как в кислой, так и в щелочной среде с использованием восстановителя цинковой пыли.

Элементный качественный анализ йодсодержащих органических лекарственных веществ производных алифатического, ароматического и гетероциклического рядов осуществляют двумя путями. Либо нагревают Йод-производное в пробирке на пламени горелки, либо воздействуют концентрированной серной кислотой. И в том, и в другом случаях органическая часть молекулы разрушается, а образование молекулярного йода наблюдают по выделению фиолетовых паров или по окраске в фиолетовый цвет хлороформного извлечения (йодоформ). Иногда (ти-реодин) органическую часть молекулы разрушают спеканием со смесью нитрата калия и карбоната натрия. Образовавшийся йодид-ион обнаруживают действием активного хлора, а выделившийся йод извлекают хлороформом (красно-фиолетовое окрашивание).

Фтор и хлор открывают обычными аналитическими реакциями после разрушения органической части молекулы расплавленным металлическим натрием (фторотан). Образовавшиеся фторид-ионы затем обнаруживают по исчезновению красного окрашивания раствора тиоцианата железа (III), а хлорид-ионы — реакцией с раствором нитрата серебра.

Для обнаружения органически связанного фосфора используют методику окисления фосфат-иона. Из окислителей используют смесь концентрированных серной и азотной кислот. Фосфат-ион обнаруживают реакцией осаждения в виде фосфата магния-аммония (белый осадок) или в азотнокислой среде реакцией с молибдатом аммония (желтый осадок).

Способы минерализации висмут-, мышьяк- и ртутьсодержащих элементоорганических веществ можно разделить на три группы: озо-ление (сжигание и прокаливание), минерализация в присутствии окислителей и минерализация в присутствии восстановителей.

Способ озоления пригоден только для соединений висмута, так как мышьяк и ртутьсодержащие соединения при этом возгоняются.

Минерализацию в присутствии окислителей осуществляют смесью концентрированных серной и азотной кислот, а также концентрированной серной кислотой в присутствии пероксида водорода или пер-манганата калия. Оба эти способа пригодны для качественного и количественного анализа органических соединений мышьяка и ртути.

Минерализацию в присутствии восстановителей выполняют, используя смесь концентрированной серной кислоты с сульфитом калия. Такой способ применим для анализа мышьяксодержащих элементоорганических лекарственных веществ.

Качественный анализ ртутьсодержащих лекарственных веществ основан на предварительном превращении в ионогенное состояние ртути нагреванием в растворе соляной кислоты. Затем открывают ион ртути, используя в качестве реактива раствор йодида калия.

Идентификация подлинности органических лекарственных веществ. Химические реакции, применяемые для установления подлинности органических лекарственных веществ, можно разделить на три основные группы:

общие химические реакции органических соединений;

реакции образования солей комплексных соединений;

реакции, используемые для идентификации органических оснований и их солей.

Эти группы реакций основаны на использовании функционального анализа. Функциональной группой называют реакционноспособный атом, группу атомов или реакционный центр в молекуле органического соединения. Поскольку те или иные функциональные группы обусловливают фармакологическую активность вещества, функциональный анализ позволяет дать объективную оценку его подлинности, которую подтверждают с помощью реакций на ту или иную функциональную группу. При этом происходит образование растворимого или нерастворимого в воде продукта реакции, а использование цветореагентов дает окрашенные соединения. В качестве реактивов применяют как неорганические ионы и комплексные соединения, так и органические вещества различной химической структуры. Наиболее просты по выполнению цветные реакции, выполняемые при участии ионов и органических реагентов в водной среде. Их используют для испытания подлинности, а также в фотометрическом и спектрофотометрическом анализах.

При взаимодействии ряда неорганических солей, комплексных соединений, органических реагентов с органическими лекарственными веществами образуются белые или окрашенные осадки. Реакции осаждения позволяют установить подлинность препарата. Нередко внешний эффект реакции (окраска, растворимость, кристаллическая форма), а также температура плавления, растворимость, кристаллизация и другие константы позволяют идентифицировать лекарственное вещество и дифференцировать его от других препаратов данной химической группы. Кроме того, реакции осаждения, сопровождающиеся образованием труднорастворимых осадков постоянного химического состава, могут быть применены в количественном анализе. На основе таких реакций разработаны многочисленные методики анализа, в которых использованы гравиметрические, турбидиметрические, полярографические; экстракционно-фотометрические, амперометрические и другие методы анализа.

Общие химические реакции органических соединений. Для фармацевтического анализа применимы те же три типа химических реакций, которые используют для синтеза: реакции замещения (нитрование, галогенирование, конденсация карбонильных соединений); реакции превращения заместителей (диазотирование и азосочетание, ацилирование, этерификация); реакции окисления-восстановления. В фармацевтическом анализе применяют такие химические процессы, основанные на реакциях элиминирования или гидролиза: де-сульфирование, дегалогенирование, гидролиз сложных эфиров и ацилированных производных, разложение третичных анионов, ами-нопроизводных и продуктов конденсации.

Реакция нитрования и нитрозирования. Нитрование ароматического ядра применяют для идентификации ряда препаратов (фенобарбитала, фенацетина, дикаина). Появляющееся характерное (желтое) окрашивание обусловлено образованием моно-, ди- и тринит-ропроизводных. Фенолы при этом образуют окрашенную в желтый цвет ациформу нитрофенола. Подобные продукты реакции дают в этих условиях некоторые вторичные ароматические амины, например дикаин, который образует калиевую соль о-хиноидного соединения, окрашенную в кроваво-красный цвет.

Ряд лекарственных веществ, содержащих в молекуле нитрогруппу (левомицетин, производные нитрофурина) или продукты нитрования (производные пропанового ряда, дикаин), под действием едких щелочей (гидроксидов) образуют окрашенные ацисоли.

Процесс нитрования с образованием тринитросоединений троповой или дифенилуксусной кислот, являющихся продуктами кислотного гидролиза сложных эфиров производных тропина, лежит в основе реакции Витали-Морена. В результате реакции под действием гидроксида калия образуется окрашенное в фиолетовый цвет соединение хиноидной структуры. Образование окрашенных продуктов из нитросоединений под действием раствора гидроксида натрия используют для идентификации производных нитрофурана. Предполагают, что окраска обусловлена расщеплением фуранового цикла.

Нитрозирование ряда гетероциклических веществ с подвижным атомом водорода в молекуле (антипирина, бутадиона и др.) приводит к образованию окрашенных нитрозосоединений, которые можно использовать для идентификации. Окрашенные продукты реакции при этом дают производные барбитуровой кислоты, содержащей имин-ную группу. Гидразины (апрессин) и пиперазины образуют с азотистой кислотой нитрозосоединения со стабильной температурой плавления. Реакция нитрозирования вторичных аминов в ряде случаев (резерпин) сопровождается флуоресценцией. Нитрозирование с последующим окислением до индофенола используют для идентификации производных фенолов. Индофенол — вещество интенсивно-синего цвета.

Ароматические амины (анестезин, новокаин, аминоакрихин) при окислении превращаются в орто- или пара-хинонимины. Последние, вступая в реакцию конденсации с ароматическими аминами, образуют индофенол.

С образованием индофенольных красителей связано взаимодействие с фенолами и их производными таких реактивов, как 4-амино-антипирин, диметил- и диэтил-н-фенилендиамин. Окрашенные продукты образуются в присутствии окислителей. Реакции отличаются высокой чувствительностью. Можно идентифицировать и вещества, содержащие в молекуле активную метиленовую группу. При использовании первого реактива в щелочной среде возникает красное окрашивание, а второго — синее или фиолетово-синее. Положительные результаты дают осарсол, хинозол, мезатон и др. Указанные реактивы с аммиачным раствором бутадиона в присутствии окислителей образуют белые осадки.

К реакциям, основанным на образовании индофенолов, следует отнести так называемую фенолгипохлоритную реакцию, которую использовали еще в XIX в. для обнаружения аммиака и других азотсодержащих соединений после их минерализации. Позже было установлено, что окрашенные соединения при определенных условиях дают также мочевина, ацетамид, некоторые барбитураты. При использовании в качестве реактивов 1%-ного раствора гипохлорита натрия, 5%-ного водного раствора фенола и 0,1 М раствора соляной кислоты окрашенные соединения образуют ряд производных пурина (кофеин, теобромин, теофиллин, дипрофиллин). Цвет и интенсивность окраски зависят от условий выполнения реакции. Установлено, что в образовании индофенольных красителей участвуют два атома азота пуринового цикла после расщепления имидазольного кольца.

Реакции диазотирования и азосочетания. Некоторые аминопроизводные гетероциклического ряда (этакридина лактат) образуют окрашенные диазосоединения. Диазотирование и последующее азосочетание широко используют как для качественного анализа лекарственных препаратов, производных первичных ароматических аминов (анилина, сульфаниламидов, производных и-аминобензойной кислоты и др.), так и для идентификации фенолов. Для анализа фенолов используют диазореактив, представляющий собой соль диазония. Азосочетание с фенолами и нафтолами наиболее благоприятно происходит в слабощелочной среде, а с аминами — в слабокислой.

Реакции диазотирования и азосочетания используют также для идентификации сложных эфиров, фенолов, ароматических ацилированных аминов и нитропроизводных.

Реакции галогенирования и дегалогенирования. Их широко применяют для количественного анализа непредельных соединений, спиртов, фенолов» ароматических аминов, галогенопроизводных и других лекарственных веществ. Галогенирование происходит по типу реакций присоединения и замещения. Например, обнаружение непредельных соединений основано на реакциях присоединения брома (последний при этом обесцвечивается). Способ не пригоден, если одновременно происходит реакция окисления или замещения (например, в присутствии фенолов, енолов, аминов). К методам галогенирования, протекающим по типу реакции замещения, может быть отнесена йодоформная проба, применяемая для идентификации этилового спирта и соединений, содержащих этоксильную группу (анестезин). Образующийся йодоформ выпадает в виде желтого осадка, имеющего характерный запах.

Для фармацевтического анализа широко применяют реакции бромирования или йодирования производных фенолов или ароматических аминов. Они протекают по типу реакций электрофильного замещения. Наличие в молекулах этих соединений заместителей первого ряда (окси- и аминогрупп) обусловливает количественно происходящий процесс бромирования с образованием белого осадка трибромфенола или триброманилина. Аналогично происходит процесс йодирования указанных производных. Если аминогруппа или фенольный гидроксил ацилированы, то предварительно проводят процесс гидролиза (в кислой или щелочной среде). Если у фенола или анилина в орто-или пара-положении находятся радикалы, то образуются моно- или дигалогенопроизводные.

В реакции галогенирования вступают не только ароматические, но и гетероциклические соединения, содержащие фенольный гидроксил, в том числе витамины, антибиотики.

Процесс, обратный галогенированию, — дегалогенирование — используют для анализа хлор-, бром- и йодпроизводных органических лекарственных препаратов. Галогены в органической молекуле связаны не ионогенной, а ковалентной связью. В зависимости от прочности этой связи применяют различные способы дегалогенирования, например отщепление галогена под действием раствора нитрата серебра. Дехлорирование можно проводить нагреванием препарата (хлорэтил, хлороформ) в спиртовом растворе едкой щелочи или водно-спиртовой среде с раствором нитрата серебра. Этот способ лежит в основе определения органически связанного хлора в молекуле производных бис-(р-хлорэтил) -амина. Происходит процесс дехлорирования (обратный, синтез) с образованием хлорид-иона. Последний сразу же осаждается ионом серебра. В отличие от элементного анализа органическая часть молекулы при этом не разрушается. Если ковалентная связь более прочна, то хлорид-ион образуется только после предварительного нагревания препарата с раствором гидроксида натрия.

Таким же образом анализируются бромсодержащие органические вещества (бромизовал). Образовавшийся при кипячении в растворе щелочи ион брома окисляют хлорамином до свободного брома, который окрашивает слой хлороформа в желто-бурый цвет.

Реакции десульфирования. Используют для анализа производных п- метан -сульфата натрия и производных сульфоната натрия. Производные л-метан-сульфата натрия (стрептоцид растворимый, анальгин) при нагревании в присутствии минеральных кислот разлагаются с образованием диоксида серы и формальдегида, которые выявляют по характерному запаху. Сульфонаты (викасол) в этих условиях образуют диоксид серы.

Реакции конденсации карбонильных соединений. Используют для идентификации лекарственных веществ, содержащих в молекуле аминогруппу, альдегидную и кетогруппу. При взаимодействии альдегидов с первичными аминами в кислой среде происходит конденсация с образованием оснований Шиффа. Эти соединения обычно имеют желтую, красную или оранжевую окраску. Реакцию используют для обнаружения сульфаниламидов и других первичных ароматических аминов, применяя в качестве реактивов 4-диметиламинобензальде-гид, коричный и другие альдегиды. Реакция образования окрашенных оснований Шиффа лежит в основе лигниновой пробы на первичные ароматические амины.

Для выявления кетопроизводных используют реакции образования гидразонов и реакции получения кетоксимов. Кетоны, вступая в реакции конденсации с различными гидразинами (фенилгидразин; 2,4-динитрофенилгидразин), образуют гидразоны, а взаимодействуя с гидроксиламином — кетоксимы. И те, и другие представляют собой бесцветные или слегка окрашенные устойчивые соединения, нерастворимые в воде, со стабильной температурой плавления. Это позволяет использовать их для установления подлинности таких ке-тонов, как камфора, бромкамфора, а также стероидных соединений, содержащих в молекуле кетогруппу.

В фармацевтическом анализе используют также процесс, обратный конденсации, в результате которого образуются альдегиды и кетоны. Последние затем обнаруживают по характерному запаху или с помощью цветных реакций (фтивазид и др.)

Реакции окислительной конденсации. Процесс окислительного расщепления и образования азометинового красителя лежит в основе нингидриновой реакции. При нагревании с нингидрином (трикето-гидринденгидрат) растворов аминокислот, иминокислот, пептонов, полипептидов, первичных и вторичных алифатических аминов возникает окрашивание. Наиболее широко эту реакцию используют для идентификации и фотоколориметрического определения а- и р-ами-нокислот, в присутствии которых появляется темно-синяя окраска, обусловленная образованием замещенной соли дикетогидриндили-дендикетогидрамина — продукта конденсации избытка нингидрина и восстановленного нингидрина с аммиаком, выделившимся при окислении испытуемой аминокислоты. Следует заметить, что появляющаяся окраска присуща не одному соединению, а нескольким окрашенным веществам в зависимости от химической структуры исходной аминокислоты. Однако во всех случаях образуются фиолетового цвета бис-1,3-дикетоинденил. С помощью нингидриновой реакции определяют глутаминовую, аминокапроновую аминокислоты, фени-бут, аминалон, метионин, сарколизин, дийодтирозин и др.

Кроме аминокислот и их производных, нингидрин в слабощелочной среде образует окрашенные как и в случае алифатических аминокислот сине-фиолетовые продукты реакции с метазоном и эфедрином. Положительную реакцию в этих условиях дают также рибофлавин (зеленое окрашивание), изониазид (нестойкое красное), эуфиллин (красно-фиолетовое).

Похожа по химизму с нингидриновой реакцией мурексидная проба, основанная на окислении молекулы пурина с образованием метилированных производных аллоксантина. Последующее воздействие раствором аммиака приводит к образованию аммонийной соли метилированного производного пурпуровой кислоты, окрашенного в пурпурно-красный цвет. Мурексидную пробу используют для испытания подлинности производных пурина (кофеин, теобромин, теофиллин и др.).

Альдегиды, спирты, органические кислоты, ангидриды кислот, барбитураты образуют окрашенные продукты конденсации с фенолами. Процесс конденсации лежит в основе цветной реакции формальдегида с салициловой и хромотроповой кислотами.

В этих цветных реакциях последовательно происходят процессы конденсации, а затем окисления с образованием окрашенных соединений парахиноидной структуры (ауриновый краситель). Концентрированная серная кислота оказывает дегидратирующее действие в реакции конденсации и, кроме того, является окислителем при образовании хиноидного соединения. Эту цветную реакцию применяют для обнаружения формальдегида, выделяющегося при окислении метилового спирта, а также при гидролизе некоторых лекарственных веществ (никодин, метазид, гексамидин и др.).

К этому же типу можно отнести реакцию резорцина с фталевым ангидридом, сопровождающуюся образованием флуоресцеина. Реакция образования ауринового красителя лежит в основе взаимодействия гексаметилентетрамина с фенолами в присутствии концентрированной серной кислоты. Этот реактив образует окрашенные соединения и с ментолом, терпингидратом, промедолом (красное), а также с производными бензиновой кислоты — амизилом, бензацином, метацином (сине-зеленое) и этакридином (зеленое). Вместе с тем производные дифенилуксусной и дифенилпропионовой кислот (апрофен, спазмолитик) в этих условиях не дают положительной реакции.

Рад лекарственных веществ, содержащих в молекуле фенильный радикал (промедол, фенобарбитал), подвергается формальдегидом и концентрированной серной кислотой окислительной конденсации. При осторожном наслаивании на раствор формальдегида в концентрированной серной кислоте раствора препарата на границе слоев появляется кольцо красного цвета (проба Ле Розена).

Ароматические альдегиды образуют окрашенные продукты с соединениями, содержащими в молекуле активную метиленовую группу (камфора).

С помощью ванилина можно обнаружить наличие индольного цикла в молекуле (стрихнин, резерпин).

Реакции этерификации, ацилирования и гидролиза. Для выявления веществ, содержащих в молекуле спиртовой (фенольный) гидроксил или карбоксильную группу, используют реакцию этерификации, а для идентификации сложных эфиров — обратный процесс — гидролиз (омыление). Этерификация протекает в присутствии дегидратирующих веществ (концентрированная серная кислота), а гидролиз — в кислой или щелочной среде. Аналогичный процесс лежит в основе идентификации простых эфиров. Применение в анализе находит и реакция ацилирования (особенно ацетилирования) аминопроизводных и обратный процесс — гидролиз ацильных производных. Образовавшиеся в результате этих реакций сложные эфиры, ацильные производные и продукты гидролиза могут иметь характерный запах, стабильную температуру плавления или другие константы, подтверждающие подлинность лекарственного вещества. Реакции этерификации, которые сопровождаются образованием этилацетата, имеющего характерный запах, применяют, например, для идентификации производных этилового спирта или уксусной кислоты (калия ацетат).

Чаще для испытания подлинности используют процесс гидролиза эфиров и ацильных производных (парацетамол, фенацетин и др.). Концентрированную серную кислоту применяют для гидролиза простых эфиров (кодеин, хинин, котарнина хлорид). Гидролиз простых арилалифатических эфиров (димедрол) основан на дезалкилирова-нии при нагревании в присутствии минеральных кислот.

Для идентификации сложных эфиров салициловой кислоты (ацетилсалициловой кислоты, метилсалицилата, фенилсалицилата) проводят гидролиз и в кислой, и в щелочной средах. Образовавшиеся продукты гидролиза идентифицируют с помощью цветных реакций, органолептически (по запаху) или по температуре плавления. Сложные эфиры арилалифатических кислот определяют путем щелочного гидролиза с последующим установлением температуры плавления выделенных кислот. Сложные эфиры азотной кислоты (нитроглицерин, эринит) образуют при гидролизе нитраты, которые затем и обнаруживают, используя в качестве реактива дифениламин. Иногда для выявления сложных эфиров их в начале подвергают гидролизу, а затем проводят этерификацию образовавшейся органической кислоты спиртом (амилнитрит, кислота ацетилсалициловая) или, наоборот, выделившегося спирта кислотой (мепротан). Возможен также вариант, когда полученные при гидролизе двойного эфира (кокаин) спирт и кислота взаимодействуют между собой с образованием сложного эфира. Его обнаруживают по характерному запаху или по температуре плавления.

Для веществ, содержащих в молекуле сложноэфирную, лактонную или лектамную группы, общим способом испытаний является гидроксамовая реакция. Если процесс гидролиза сложных эфиров выполнять в щелочной среде в присутствии гидроксиламина, то образуются гидроксамовые кислоты, которые взаимодействуют с солями металлов, ионов железа (III), и в зависимости от рН среды образуют различные по составу и окраске продукты реакции (красно-бурая, вишне во-красная, красно-фиолетовая). Особенно часто эту реакцию применяют для идентификации сложных эфиров (салициловой кислоты — фенилсалицилат, метилсалицилат, л-аминобензой-ной кислоты, алифатических и других кислот), содержащих сложную эфирную группу, алкалоидов (атропин, кокаин), стероидных гормонов (кортизона ацетат, тестостерона пропионат и др.), высших жирных кислот, коллагенов, пептидных связей в белках. Дают эту реакцию также амиды (бромизовал, фенацетин, парацетамол, нитразепам) и имиды (барбитураты, бемегрид, фенсукцинимид).

С гидроксиланом легко реагируют сложные эфиры, значительно медленнее в сильнощелочной среде и при повышенной температуре — амиды и имиды. Также в щелочной среде вступают в эту реакцию лактоны (пилокарпин и сердечные гликозиды с лактоновым циклом). Для образования окрашенных комплексов наряду с солями железа (III) используют соли меди (II), реже другие катионы металлов. Синтетические и природные пенициллины, содержащие р-лактамный цикл, образуют гидроксамат меди при рН 7,0, цефалоспорины при рН 6,0 в присутствии никеля. Образование устойчивых красно-фиолетовых комплексов гидроксамовых кислот с солями железа (III) в кислой среде (рН 1,5—3,0) с максимумом светопоглощения в области 470—540 нм использовано для фотометрического определения большинства указанных лекарственных веществ. При выборе условий выполнения анализа важное значение имеют не только химическая структура препарата, но и природа растворителя, рН среды, температура.

Реакция разложения аминов и аминопроизводных. Некоторые соли четвертичных аммониевых оснований при нагревании до плавления выделяют триметиламин, другие (ацетилхолин-хлорид) разлагаются с его выделением под действием щелочей. Амиды ароматических, гетероциклических кислот при нагревании в растворах едких щелочей (гидроксидов) разлагаются с образованием аммиака или соответствующего алкил- или диалкиламина, которые регистрируют по характерному запаху. Этот процесс лежит в основе испытаний подлинности амида салициловой, диэтиламида никотиновой и других кислот. Производные уретана под действием щелочей образуют спирт, аммиак и карбонат натрия (прозерин, пармидин, мепротан).

Вещества, содержащие в молекуле уреидную группу, гидролизу-ются в кислой и в щелочной средах по общей схеме. Для испытания подлинности циклических и ациклических уреидов, алкилуреидов сульфокислот, производных гуанидина и семикарбазона используют реакцию гидролиза в щелочной среде. При этом образуется аммиак, который обнаруживают по запаху или изменению окраски влажной красной лакмусовой бумаги. Мочевина, образующая под действием щелочей производные гуанидина, разлагается до аммиака и карбоната натрия. Если на продукты щелочного гидролиза подействовать избытком минеральной кислоты, то наблюдается выделение газа (диоксид углерода). Продукты гидролиза ациклических и циклических уреидов при этом нейтрализуются с образованием соответствующей жирной кислоты, которую обнаруживают по запаху.

Амиды сульфаниловой кислоты идентифицируют реакцией пиролитического расщепления (пиролиза) плавлением порошка лекарственного вещества в пробирке. При этом выделяется аммиак (или другие газы), придающий веществу характерную окраску. Реакцию разложения нагреванием в присутствии карбоната натрия используют для обнаружения некоторых производных пиридин карбоновых кислот и их амидов. Образуется пиридин, определяемый по запаху.

Реакции окисления-восстановления. Лежащие в основе многих химических реакций, эти реакции используют для испытания подлинности лекарственных веществ. Реакцию гидрирования нитросоединений (металлическим цинком в присутствии соляной кислоты) применяют для получения аминов и последующего образования из них окрашенных диазо- и азосоединений. Процесс гидрирования, основанный на присоединении водорода по месту двойной связи, можно использовать для идентификации непредельных соединений. Препараты, содержащие в молекуле непредельные связи (сферофизи-набензоат, карбокромен, нистатин, амфотерицин В), под действием окислителей (перманганат калия) подвергаются окислительной гидратации. Происходит обесцвечивание раствора перманганата калия.

Препараты, содержащие в молекуле хинонную группу (викасол), под действием восстановителей (цинковая пыль в присутствии минеральных кислот) гидрируются до образования фенольных групп.

Реакцию окисления спиртов до альдегидов используют для идентификации веществ, содержащих первичную спиртовую группу. Вторичные спирты при окислении образуют кетоны.

В фармацевтическом анализе широко используют реакцию окисления альдегидов до кислот.

Восстановительные свойства производных альдегидов (формальдегид, хлоралгидрат, цитраль, глюкоза), изоникотиновой кислоты (изониазид, салюзид), стероидных гормонов, содержащих в молекуле а-кетольную группу, антибиотиков тетрациклинового ряда и стрептомицина устанавливают с помощью реакции образования «серебряного зеркала», а также реактивами Фелинга и Несслера. Реакция «серебряного зеркала» основана на восстановлении серебра из его солей в аммиачном растворе. Реактив Фелинга представляет собой смесь двух приготавливаемых отдельно растворов: раствора сульфата меди и раствора, содержащего соль винной кислоты (сеньетова соль) и гидроксид натрия. При смешивании этих растворов с альдегидами после нагревания образуется вначале желтый осадок гидроксида меди (I), а затем красный осадок оксида меди. Процесс окисления лежит в основе реакции «серебряного зеркала» и реактива Фелинга для обнаружения а-кетольной группы в стероидных соединениях (кортизона ацетат, гидрокортизон, преднизолон, ДОКСА). Действие реактива Несслера основано на восстановлении ртути в щелочной среде.

Восстановительные свойства альдегидов можно использовать для испытания подлинности неорганических лекарственных веществ (соединения ртути, серебра).

Вещества, содержащие в молекуле гидразиновую группу (изониазид, апрессин), окисляются под действием раствора сульфата меди и аммиачного раствора нитрата серебра. Под действием минеральных кислот а-гидроксикарбоновой кислоты адреналина гидротартрат, натрия цитрат, кальция лактат, ациклидин, платифиллина гидротартрат разлагаются.

Многие лекарственные вещества претерпевают химические изменения под действием окислителей. Окрашенные продукты окисления образуют гетероциклические соединения, производные пиразо-лона и фенотиазина; алкалоиды, производные бензилизохинолина (папаверин), фенантрена (морфин, кодеин, апоморфин), индола (резерпин). Процесс окисления использован в мурексидной (тауриновые алкалоиды) и таллейохинной (хинин) пробах. В основе испытаний подлинности гормонов, имеющих в молекуле фенольный гидроксил, а также препаратов ряда витаминов лежит процесс окисления. В качестве окислителей используют галогены (раствор йода, бромную воду) или вещества, легко отщепляющие галогены (хлора-мины, гипохлориты), а также растворы пероксида водорода, перман-ганата калия, солей церия и др.

Реакции образования солей и комплексных соединений. Эти реакции с использованием неорганических солей железа (III), меди (II), серебра, кобальта, ртути (II), кадмия, свинца, сурьмы широко используют для испытания подлинности карбоновых кислот (в том числе аминокислот, оксикислот), производных барбитуровой кислоты, спиртов, фенолов, сульфаниламидов, некоторых алкалоидов, гормонов, антибиотиков. Соответствующие соли или комплексные соединения образуются за счет наличия в молекулах карбоксильной группы, вторичной аминогруппы и спиртового гидроксила. Образование из органических кислот солей и комплексных соединений происходит по общей схеме, алифатические амины вступают в реакцию комплексообразования. Реакции на натриевые, калиевые, кальциевые соли, соли органических кислот, в том числе сульфаниламидов, витаминов, антибиотиков и др., выполняют так же, как и при испытании неорганических лекарственных веществ. Для идентификации используют реакцию нейтрализации натриевых (калиевых) солей органических кислот (бензойной, салициловой и др.). Выделившиеся в воде нерастворимые кислоты осаждаются, затем их идентифицируют по температуре плавления или цветными реакциями с ионами тяжелых металлов.

В фармацевтическом анализе широко применяется хлорид железа (III). Взаимодействуя с фенолами, он образует комплексные ионы феноксидов (фенолятов) железа. Они в зависимости от присутствия в молекуле тех или иных функциональных групп могут иметь различную химическую структуру. Феноксиды железа окрашены в синий или фиолетовый цвет (фенол, резорцин и др.). Установлено, что наличие карбонильной и некоторых других групп в ортоположении к фенольному гидроксилу обусловливает фиолетовую окраску испытуемого вещества, в параположении — желтую или красную; метазамещенные фенолы не образуют окрашенных соединений (тимол).

Окрашивающиеся соединения с хлоридом железа (III) образуют лекарственные вещества, содержащие в своей молекуле фенольный гидроксил: производные я-аминофенола, сложные эфиры салициловой кислоты и производные салициламида с незамещенным феноль-ным гидроксилом, оксипиридиновые витамины и витамины группы флавоноидов, производные 8-оксихинолина, 4-окси кумарина, препараты гормонов, являющихся производными аминофенолов, антибиотики тетрациклинового ряда, продукт щелочного гидролиза стрептомицина — мальтол и ряд других веществ.

Соли тяжелых металлов используют в качестве реактивов для обнаружения органических кислот различной химической структуры: лимонной, бензойной, цинхониновой; аминокислот, и-аминосалициловой и др.

Вещества, содержащие в молекуле меркаптогруппу (цистеин, мер-казолил, меркаптопурин), образуют с солями тяжелых металлов нерастворимые в воде меркаптиды, которые под действием растворов едких щелочей гидролизуются с образованием сульфидов. Последние можно обнаружить с помощью цветных реакций, используя в качестве реактивов нитропруссид натрия или ацетат свинца.

Препараты, содержащие в молекуле сульфогруппы (хиниофон, сигенин, диазолин), взаимодействуя с ионами бария, образуют осадки.

Ионы железа (III), серебра, меди (II), кобальта позволяют подтвердить наличие амидной группы в молекулах сульфаниламидов, барбитуратов, пуринов. Соли меди (II) в нейтральной среде дают комплексные соединения с сульфаниламидами. Подобные комплексы с сульфаниламидами образуют и ионы других тяжелых металлов. Различие в растворимости и окраске позволяет идентифицировать получаемые продукты.

Препараты, молекула которых включает циклическую уреидную группу (барбитураты, производные пурина), с солями тяжелых металлов в присутствии гидроксида натрия образуют комплексные окрашенные соединения (сине-фиолетовые с солями кобальта и кальция; голубые до сиреневых с солями меди). Кроме того, соли тяжелых металлов позволяют выявлять некоторые алкалоиды (цитизин), витамины (рибофлавин, фолиевую и никотиновую кислоты, витамины группы А и D).

Часто в качестве реактива используют нитропруссид натрия, с помощью которого испытывают на подлинность производные тио-семикарбазона (метасазон), сульфаниламиды, производные имидазола (мерказолил, нафтизин), пиридина (ипразид), фурохромона (келлин), изоникотиновой кислоты (изониазид), а также некоторые алкалоиды (пилокарпин, теофиллин, пахикарпин, сферофизин) и ряд сердечных гликозидов. Окраска возникает вследствие замещения нитрозогруппы в ионе нитропруссида.

Сходный по химической структуре с нитропруссидом пентациано-акваферриат натрия образует окрашенные в синий или зеленый цвет соединения с первичными ароматическими аминами, серосодержащими соединениями (меркаптанами, тиокетонами и др.), в том числе с производными тиоурацила. Пентацианоаминоферроат натрия образует окрашенные вещества, взаимодействуя с гидразинами (красного или фиолетового цвета), изоникотиновой кислоты, л-оксиуретанами.

Идентификация органических оснований и их солей. Она предусматривает использование двух групп реакций. Одна основана на осаждении органического основания и обнаружении связанной с ним кислоты, другая заключается в использовании так называемых оса-дительных и специальных реактивов.

Общим испытанием на соли оснований с неорганическими или органическими кислотами является реакция нейтрализации растворами гидроксида натрия. Большинство оснований при этом выпадает в осадок. Образовавшееся основание можно извлечь органическим растворителем, а затем установить температуру плавления или идентифицировать с помощью цветной реакции.

Соли органических оснований идентифицируют по аниону соответствующей связанной кислоты: соляной — по хлорид-иону, серной — по сульфат-иону, бромводородной — по бромид-иону, йодводородной — по йодид-иону, фосфорной — по фосфат-иону, азотной — по нитрат-иону. Йодметилаты и бромметилаты, связанные с органическими основаниями, идентифицируют соответственно по йодид-или бромид-иону.

Тартраты обнаруживают по связанной винной кислоте, осаждая ее ионом калия, салицилаты и бензоаты открывают ионом железа (III), лактаты испытывают с помощью реакции на молочную кислоту (по обесцвечиванию раствора перманганата калия). Тартраты можно обнаружить также цветными реакциями. В среде уксусной кислоты после добавления растворов сульфата железа (II), пероксида водорода и гидроксида натрия появляется пурпурное или фиолетовое окрашивание. При действии на тартраты концентрированной серной кислотой, резорцином, бромидом калия и нагревании на водяной бане (5—10 мин) появляется интенсивно-синее окрашивание. После охлаждения жидкость выливают в воду, раствор приобретает красный цвет.

Известно более 200 «осадительных реактивов», применяемых для идентификации органических оснований и их солей. Чаще это — комплексные неорганические (иногда органические) соединения.

Наиболее употребительны следующие осадительные реактивы: раствор йода в йодиде калия (реактив Вагнера—Бушарда); раствор йодида висмута в йодиде калия (реактив Драгендорфа); раствор йодида ртути в йодиде калия (реактив Майера); раствор йодида кадмия в йодиде калия (реактив Марме); фосфорновольфрамовая кислота (реактив Шейблера); фосфорномолибденовая кислота (реактив Зонненштейна); кремневольфрамовая кислота (реактив Бертрана); дихлорид ртути (сулема); платинохлороводородная кислота; золотохлороводородная кислота; стифниновая кислота; пикроноло-вая кислота; раствор танина (водный или спиртовой).

Осадительные реактивы дают положительные реакции с веществами алифатической (амины), ароматической (фенолы, производные л-аминобензойной кислоты), гетероциклической (производные пиразолона, пиридина, хинолина, фенотиазина и др.) структуры.

Для идентификации органических оснований и их солей широко используют концентрированную серную или соляную кислоту и их смесь. В основе их взаимодействия с органическими основаниями — реакции окисления и конденсации. При этом концентрированная серная кислота — реактив не только для органических оснований, но и для сердечных гликозидов, гормонов.

Кроме перечисленных при фармацевтическом анализе широко применяют различные цветореагенты: ксантгидрол; водный раствор 1,2-нафтохинон-4-сульфоната натрия (для первичных ароматических аминов, например сульфаниламидов); 2,3-дихлор-1,4-нафтохи-нон (первичные амины, производные гидразина, натриевые соли слабых кислот, вещества с активной метиленовой группой в молекуле; все они образуют окрашенные соединения и с первым реактивом); хлоранил и его производные — хлораниловую кислоту, хлоранило-вокислую ртуть (цветные реакции с аминоспиртами, арилалкилами-нами, оксифенилалкиламинами, гидразидами изоникотиновой кислоты, первичными ароматическими аминами, причем последние приобретают красное окрашивание, а вторичные и третичные амины — зеленое, сине-зеленое или фиолетовое, что делает эти реакции селективными); ароматические С-нитрозосоединения, как 1-нитрозо-2-на-фтол, нитрозо-К-соли, л-нитрозодиметиланилин, нитрозоантипирин, я-нитрозодифениламин (окрашивание с первичными ароматическими аминами, веществами, содержащими подвижные атомы водорода, образуются азометиновые производные и хинонимины; с вторичными ароматическими аминами, производными индола и др.).

Способы испытаний на чистоту. Источники загрязнения лекарственных веществ. Ими являются технологические и специфические примеси — исходное сырье, аппаратура и другие вещества, используемые для получения лекарственных средств. Материал, из которого изготовлена аппаратура (металл, стекло, пластмасса), может служить источником примесей тяжелых металлов, мышьяка и других веществ. При плохой очистке в препаратах могут быть примеси растворителей, волокна тканей или фильтровальной бумаги, песок, асбест и т. д., а также остатки кислот или щелочей. На качество лекарственных веществ могут влиять и другие факторы.

Технологические факторы, такие, как степень чистоты исходных веществ, температурный режим, давление, рН среды, растворители, сушка, могут быть источником различных примесей, накапливающихся от одной стадии производства к другой. При этом возможно образование продуктов побочных реакций или продуктов распада и появление таких промежуточных веществ, от которых трудно затем отделить основной продукт. В процессе синтеза возможно также образование различных таутомерных форм как в растворах, так и в кристаллическом состоянии. Например, многие органические соединения могут существовать в амидной, имидной и других таутомерных формах. Причем в зависимости от условий получения, очистки и хранения вещество может представлять собой смесь двух таутоме-ров или других изомеров, в том числе оптических, различающихся по фармакологической активности.

Вторая группа факторов — образование различных кристаллических модификаций, или полиморфизм. Около 65% лекарственных веществ, относящихся к числу барбитуратов, стероидов, антибиотиков, алкалоидов и др., образуют по 1—5 и более различных модификаций. Остальные дают при кристаллизации стабильные полиморфные и псевдополиморфные модификации. Они различаются не только по физико-химическим свойствам и фармакологическому действию, но имеют различную величину свободной поверхностной энергии, а следовательно, неодинаковую устойчивость к действию кислорода воздуха, света, влаги, что значительно влияет на сроки хранения.

Основные примеси в лекарственных веществах, получаемых из растительного и животного сырья, — сопутствующие природные соединения (алкалоиды, ферменты, белки, гормоны и др.). Многие из них очень сходны по химическому строению и физико-химическим свойствам с основным продуктом экстракции, поэтому его очистка представляет большую сложность.

Иногда на загрязнение одних лекарственных веществ другими может влиять запыленность производственных помещений химико-фармацевтических предприятий. В рабочей зоне этих помещений при условии получения нескольких препаратов (лекарственных форм) все они могут содержаться в виде аэрозолей в воздухе. При этом происходит гак называемое «перекрестное загрязнение». На чистоту лекарственных веществ могут влиять и операторы, участвующие в синтезе (несоблюдение личной гигиены, загрязнение спецодежды, предохранительных средств личной безопасности и др.)- Не случайно в 1976 г. ВОЗ были разработаны специальные правила организации производства и контроля качества лекарственных средств, предусматривающие предотвращение «перекрестного загрязнения». На доброкачественность лекарства влияют и условия хранения. Излишняя влажность может привести к гидролизу, в результате которого образуются основные соли, продукты омыления и др. вещества, изменяющие фармакологическое действие и усиливающие их токсичность. При хранении же препаратов-кристаллогидратов (натрия арсенат, меди сульфат и др.) необходимо, наоборот, соблюдать условия, исключающие потерю кристаллизации воды.

Под влиянием света и кислорода воздуха может происходить разложение хлорной извести, серебра нитрата, йодидов, бромидов, гидроксидов и др. Следует учитывать и качество тары, в которой хранят или транспортируют лекарственные средства.

Следовательно, примеси, содержащиеся в лекарственных веществах, можно условно разделить на две группы: технологические, образовавшиеся в процессе синтеза, и приобретенные, возникшие при хранении и транспортировке. Как те, так и другие должны строго контролироваться, а лекарственное вещество должно иметь достаточную степень чистоты, отвечающую требованиям определенной спецификации.

Принято считать, что лекарственное вещество является чистым, если дальнейшая очистка не меняет его фармакологической активности, химической стабильности, физических свойств и биологической доступности.

К сожалению, в последние годы из-за общего ухудшения экологической обстановки в лекарственном и животном сырье имеется много опасных примесей, например солей тяжелых металлов, а также некоторых мутагенов и даже канцерогенов. Существует определенный фармакопейный тест на выявление примесей тяжелых металлов, применяемый во всех национальных фармакопеях мира. Данный тест рекомендуется не только для исследования индивидуальных лекарственных веществ, но и масел, экстрактов, ряда инъекционных форм. По мнению экспертов ВОЗ, такие испытания следует проводить в отношении лекарственных средств, имеющих дозы не менее 0,5 г.

Общие требования к испытаниям на чистоту. Все лекарственные препараты независимо от способа получения испытывают на чистоту и устанавливают содержание в них примесей, которые условно делят на две группы: примеси, влияющие на фармакологическое действие препарата, и примеси, указывающие на степень очистки вещества. Последние (особенно в больших количествах) снижают общую активность препарата и могут вызывать определенные побочные эффекты. Поэтому фармакопеи устанавливают пределы этих примесей в лекарственных веществах.

Таким образом, основной критерий доброкачественности лекарственного препарата — наличие допустимых пределов физиологически неактивных и отсутствие токсичных примесей. Понятие отсутствие условно и связано с чувствительностью способа испытания. Существуют общие требования, которые предъявляются к испытаниям на чистоту, — чувствительность, специфичность и воспроизводимость используемой реакции, а также пригодность ее применения для установления допустимых пределов содержания примесей. Поэтому избирают реакции с такой чувствительностью, которая позволяет определить допустимые пределы примесей. Эти пределы устанавливают предварительной биологической проверкой с учетом возможного токсического воздействия примеси.

Содержание примесей можно определить двумя путями (эталонным и безэталонным). При использовании первого пути раствор препарата сравнивают с эталонным раствором (стандартом), наблюдая изменения под воздействием определенного реактива. Второй путь — установление предела содержания примесей по отсутствию положительной реакции, используя химические реакции, чувствительность которых ниже, чем предел обнаружения допустимых примесей.

Для ускорения и наиболее точного выполнения испытаний на чистоту, их унификации и достижения одинаковой точности анализа в фармакопеях использована система эталонов. Эталон представляет собой образец, содержащий определенное количество открываемой примеси. Наличие примесей устанавливают колориметрическим или нефелометрическим методом, сравнивая результаты реакций в растворе эталона и препарата после добавления одинаковых количеств рекомендуемых реактивов. При этом необходимо соблюдать все указания, предусмотренные фармакопеями (чистота воды, точность отвешивания до 0,001 г, последовательность добавления реактивов и т. д.).

Общие испытания на примеси неорганических ионов. Проводят согласно общей статье ГФ XI, вып. 1 (с. 165) «Испытания на чистоту и допустимые пределы примесей*, в которой указаны требования и условия выполнения испытаний на хлориды, сульфаты, соли аммония, соли кальция, железа, цинка, тяжелых металлов. Там же изложены сведения об эталонных растворах, необходимых для определения указанных примесей.

При этом:

испытание на хлориды основано на их взаимодействии с ионом серебра. Хлорид серебра дает белую опалесценцию, не исчезающую при добавлении азотной кислоты и растворяющуюся в растворе аммиака;

испытание на сульфаты основано на их взаимодействии с ионом бария. Сульфат бария образует белую опалесценцию, не исчезающую от прибавления разведенной соляной кислоты;

испытание на соли аммония основано на взаимодействии реактива Несслера с образованием желто-бурого осадка или желтого окрашивания;

испытание на соли кальция основано на взаимодействии ионов кальция с оксалат-ионами. Образующийся белый мелкокристаллический осадок (опалесценция) не исчезает при добавлении уксусной кислоты, но легко растворяется при внесении соляной и азотной кислот;

испытание на соли железа (II) и (III) в зависимости от концентрации основано на образовании с раствором сульфосалициловой кислоты в аммиачной среде коричнево-красных или желтых растворов феррилсульфосалицилатных комплексов. Окраска и состав ионов комплексов зависят от рН среды;

испытание на соли цинка основано на взаимодействии их с растворами гексацианоферрата калия (И). Образуется белый осадок, нерастворимый в кислотах;

испытание на соли тяжелых металлов основано на их взаимодействии с растворами сульфидов. Образуется черный осадок или бурое окрашивание раствора. Эталоном служит раствор соли свинца.

Обнаружение примеси мышьяка. В ГФ XI принято два способа обнаружения примеси мышьяка: реакция Зангера—Блека и реакция Буго—Тиле.

Сущность реакции Зангера—Блека — восстановление соединений мышьяка, содержащихся в испытуемом препарате, цинком в специальном приборчике до арсина. С помощью данного способа можно обнаружить в реакционной смеси 0,001 мг мышьяка. Предел чувствительности можно повысить до 0,0005 мг (обработка бумаги, пропитанной раствором дихлорида ртути, раствором йодида калия). С помощью этой реакции нельзя обнаружить примесь мышьяка в присутствии соединений сурьмы, фосфора, солей тяжелых металлов, сульфид- и сульфат-ионов.

Реакция Буго—Тиле, хотя и менее чувствительна, но позволяет обнаружить примесь мышьяка и в присутствии вышеуказанных веществ. Сущность ее — использование восстановительных свойств натриевой соли фосфорноватистой кислоты (гипофосфита натрия). Последняя восстанавливает в кислой среде соединения мышьяка (III) и (V) до свободного мышьяка. Фосфорноватистая кислота при этом окисляется до фосфористой, и в зависимости от содержания примеси мышьяка появляется бурое окрашивание или бурый осадок.

Определение летучих веществ и воды. Летучие вещества могут попасть в лекарственные препараты вследствие плохой очистки или от накопления продуктов разложения. Вода в веществе может содержаться в виде капиллярной, абсорбционной связанной, химически связанной (гидратной и кристаллогидратной) или свободной.

ГФ XI предусматривает три метода определения воды в препаратах: два физических — метод высушивания и метод дистилляции и один химический — метод акваметрии. В жидких лекарственных веществах примесь воды устанавливают по помутнению при охлаждении до О °С или с помощью пикриновой кислоты (сравнивая окраску с эталоном).

Сущность метода высушивания — установление разности массы вещества до и после высушивания (сушат вещество до постоянной массы при очередном взвешивании).

Метод дистилляции основан на физическом свойстве паров двух несмешивающихся жидкостей (например, воды и органического растворителя). При этом смесь воды с органическим растворителем перегоняют при более низкой температуре, чем каждая из этих жидкостей. Содержание воды в испытуемом препарате устанавливают по объему в приемнике после окончания процесса перегонки.

Химический метод — метод акваметрии, известный под названием метода Фишера (один из вариантов акваметрии), позволяет определить суммарное содержание как свободной, так и кристаллогидратной воды в органических, неорганических лекарственных веществах, растворителях. Преимущество метода — быстрота выполнения и селективность по отношению к воде. Реактив Фишера представляет собой раствор диоксида серы, йода и пиридина в метаноле. Процесс должен осуществляться в закрытой системе, поскольку реактив сразу же взаимодействует с атмосферной влагой. К числу недостатков метода помимо соблюдения герметичности относится невозможность определения воды в присутствии веществ, которые реагируют с компонентами реактива. Например, альдегиды и кетоны взаимодействуют с метанолом, образуя ацетали (кетали). Но если метанол в реактиве заменить диметилформамидом, то определение становится возможным. Этим реактивом невозможно определить содержание воды в присутствии аскорбиновой кислоты, меркаптанов, сульфидов, гидрокарбонатов и карбонатов щелочных металлов, оксидов, гидроксидов и некоторых других соединений.

ГФ рекомендует наряду с визуальным определением эквивалентной точки реактивом Фишера (по изменению окраски от желтой до красновато-коричневой) осуществлять титрование электрометрическим методом (до полного превращения тока в конечной точке).

Следует заметить, что методы, рекомендованные ГФ для определения влажности, имеют ряд ограничений и недостатков. Перспективен для этой цели метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием хроматографов типа «Цвет» или ЛХМ. Испытывают образцы массой 0,003—0,02 г при температуре колонок 100 °С, детектора — 140 °С, токе детектора — 100 мА, сорбенте — полисорб-1. Содержание рассчитывают методом абсолютной калибровки. Время, затрачиваемое на два параллельных анализа, не более 10 мин. Сходность результатов ±6%. Перспективными для определения влаги могут оказаться и некоторые оптические методы, например отражательная спектрофотометрия, позволяющая измерить светоотражение анализируемых поверхностей в видимой области спектра.

Установление рН среды. Этот показатель может служить характеристикой химических свойств вещества — кислотности и щелочности, по которым определяют примеси свободных кислот и щелочей. ГФ XI из многочисленных способов определения рН среды рекомендует колориметрический, потенциометрический способы и дает описания стандартных буферных растворов и индикаторов (для первого способа) и рН-метров — для второго, который отличается более высокой точностью и основан на электродвижущей силе элемента, составленного из стандартного электрода.

Испытание на чистоту по некоторым физическим и химическим свойствам. Используют для ориентировочного представления о наличии примесей в испытуемых образцах. В этих целях определяют прозрачность и степень мутности путем сравнения вертикально установленных пробирок образца с эталоном (те же жидкости и растворители); окраску жидкостей — сравнивая испытуемый раствор с эталонной жидкостью; адсорбционную способность и дисперсность, определение золы, восстанавливающих веществ, красящих веществ, кислотное число (масса гидроксида калия в миллиграммах, которая необходима для нейтрализации свободных кислот, содержащих в 1 г испытуемого вещества); число омыления (масса гидроксида калия в миллиграммах, которая необходима для нейтрализации свободных кислот и кислот, образующихся при полном гидролизе сложных эфиров, содержащихся в 1 г испытуемого вещества); эфирное число (масса гидроксида калия в миллиграммах, которая необходима для нейтрализации кислот, образующихся при гидролизе сложных эфи-ров, содержащихся в 1 г исследуемого вещества, т. е. разность между числом омыления и кислотным числом); йодное число (масса йода в граммах, которая связывает 100 г исследуемого вещества). В ГФ XI приведены методики указанных констант и способы их расчета.

Испытания на специфические примеси. Дают наибольшую эффективность при оценке чистоты лекарственного вещества. Специфические примеси могут представлять собой либо промежуточные продукты синтеза, либо продукты разложения, либо сопутствующие БАВ (из источников растительного и животного происхождения). Эти примеси влияют не только на характер фармакологического действия, но могут представлять собой токсичные продукты. Количество этих примесей строго нормируется ГФ XI и другой НТД. Суть определения этих примесей можно условно разделить на пять групп:

1)способы оценки чистоты, основанные на установлении таких констант, как температура плавления, растворимость, удельное вращение, удельный показатель поглощения растворов и др. Эти константы позволяют не только идентифицировать лекарственные вещества, но и оценивать их чистоту. В ГФ и другой НТД приведены не константы индивидуальных (свободных от примесей) веществ, а допустимые пределы значений этих констант, т. е. такие их интервалы, в которых сохраняется достаточная степень чистоты препарата;

2)способ, основанный на приготовлении эталонного раствора из вещества, являющегося примесью к данному препарату. Готовят испытуемый раствор препарата и эталонный раствор, содержащий предельно допустимое количество химически чистой примеси. Затем к обоим растворам добавляют соответствующий реактив. Интенсивность окраски или опалесценции у раствора препарата должна быть меньше, чем у эталона;

3)выделение примеси из препарата бумажной хроматографией. Одновременно получают хроматограмму «свидетеля»- (стандартного образца примеси). Проявляют хроматограмму с помощью реактивов или наблюдают окраску пятен в ультрафиолетовом свете, сравнивая результаты. Этот метод широко используют для установления примесей некоторых гликозидов в препаратах (целанида, дигитоксина), а также для обнаружения примесей посторонних стероидов в препаратах (кортизон-
ацетата, преднизона, преднизолона, метандростенолона и др.);

4)методы, основанные на избирательном взаимодействии примесей с каким-либо реактивом. При этом наблюдают появление или отсутствие опалесценции, регламентированное определенным временем;

5)метод, основанный на сочетании экстракции (чаще всего эфиром) примеси с последующей отгонкой растворителя и взвешивания остатка, который должен либо отсутствовать, либо не превышать 0,1—0,2%. Вместо взвешивания количество извлеченной примеси можно определять каким-либо титриметрическим методом. Иногда примесь извлекают водой из препарата, практически нерастворимого в воде, а фильтрат испытывают на отсутствие (присутствие) примеси с помощью какой-либо цветной реакции.

В ГФ XI и другой НТД регламентировано отсутствие или допустимые пределы примесей некоторых исходных продуктов синтеза как неорганических, так и органических веществ.

Методы количественного определения лекарственных веществ. Количественное определение лекарственного вещества — заключительный этап фармацевтического анализа. Оно выполняется после того как испытуемое вещество идентифицировано и установлено наличие допустимого количества примесей различными методами, обеспечивающими достаточную точность. Однако эти методы не всегда специфичны, особенно для органических лекарственных веществ. Обычно количественное содержание препарата устанавливают по какому-либо одному его химическому свойству, связанному наличием той или иной функциональной группы, атома (катиона, аниона), в ряде случаев — по количеству связанной с органическим основанием минеральной кислоты. В этих целях применяют четыре группы методов: химические, физические, физико-химические и биологические. При этом химические реакции, используемые для идентификации, в ряде случаев используют и для количественного определения.

Химические методы. Количественное определение лекарственных веществ можно проводить гравиметрическим (весовым) и титриметрическим (объемным) методами, газометрическим и количественным элементным анализом.

Гравиметрический (весовой) метод применяют для определения сульфатов, переводя их в нерастворимые соли бария, и силикатов, предварительно прокаливая их до диоксида кремния, а также ряда других веществ.

Рекомендуемые ГФ методы гравиметрического анализа препаратов солей хинина основаны на осаждении основания этого алкалоида раствором гидроксида натрия. Аналогично определяют бигумаль. Препараты бензилпенициллина осаждают в виде N-этилпепиридиновой соли бензилпенициллина; прогестерон — в виде гидразона. Возможно применение гравиметрии для определения алкалоидов (взвешиванием свободных от примесей основания или пикратов, пикро-лонатов, кремневольфраматов, тетрафенилборатов), а также для определения некоторых витаминов, которые осаждают в виде нерастворимых в воде продуктов гидролиза (викасол, рутин) или в виде кремневольфрамата (тиамина бромид). Известны также гравиметрические методы, основанные на осаждении из натриевых солей кислотных форм барбитуратов.

Титриметрические (объемные) методы наиболее распространены в фармацевтическом анализе, они менее трудоемки по сравнению с гравиметрическими и достаточно точны. Для этого используют титрированные растворы (титранты), имеющие точно известную концентрацию, выражаемую в нормальности. В ГФ XI, вып. 2, с. 61—81 описаны способы приготовления и установка титра таких растворов, В соответствии с СИ и рекомендациями ИЮПАК основной единицей количества вещества является моль, поэтому содержание веществ в титрантах в молярной концентрации — это выраженное в молях количество растворенного вещества в 1 л раствора (моль/л). Согласно требованиям ГФ XI молярную концентрацию с_р вычисляют двумя способами.

Способ расчета по навеске химически чистого вещества проводят по формуле

где а — масса химически чистого вещества, г; 1000 — количество миллилитров в 1 л раствора; М— молярная масса условных частиц химически чистого вещества, г/моль; V'— объем раствора, израсходованный на титрирование навески, мл.

Способ, основанный на вычислении молярной концентрации по титрованному раствору известной концентрации или по фисканалу. Расчет выполняют по формуле

где с₀ - молярная концентрация раствора вещества, по которому устанавливают титр, моль/л; V_g — объем раствора, по которому устанавливают титр, мл; V — объем раствора определяемой молярной концентрации, мл.

В приготовленных титрованных растворах вычисляют поправочный коэффициент к молярной концентрации (К). Он представляет собой отношение полученной концентрации к теоретически заданной и должен быть в пределе 0,98-1,02. При больших отклонениях величины К титрованных растворов необходимо повысить концентрацию или разбавить раствор и вновь вычислить поправочный коэффициент.

Химические вещества, позволяющие при титриметрических определениях устанавливать прибавление эквивалентного количества титранта к анализируемому веществу, называют индикаторами. Изменения, происходящие с ними в точке эквивалентности, устанавливают визуальными или инструментальными способами. В зависимости от типа используемых при анализе химических реакций индикаторы делят на кислотно-основные для водных и неводных средств, металлохромные, используемые в комплексонометрии, адсорбционные и окислительно-восстановительные. Растворы индикаторов и индикаторные смеси готовят из веществ классификации «химически чистый» (х. ч.) или «чистый для анализа» (ч. д. а.), такой же квалификации должны быть и другие, используемые при приготовлении растворов и смесей, вспомогательные вещества. В ГФ XI, вып. 2 с. 82— 102 приведены рациональные химические названия, физические свойства, способы приготовления растворов, индикаторов и индикаторных смесей, интервалы рН, при которых происходит переход окраски их растворов, а также описание индикаторной бумаги.

Используемые в фармацевтическом анализе титриметрические методы можно подразделить на осадительное титрирование, кислотно-основное, окислительно-восстановительное, комплексонометрию и нитритометрию. С их помощью количественную оценку производят, проводя определение отдельных элементов или функциональных групп, без предварительной деструкции молекулы или после ее деструкции. Указанные методы являются групповыми и не всегда дают возможность судить о доброкачественности вещества, поскольку фармакологические свойства лекарственных веществ зависят не только от указанных выше идентифицированных групп.

Осадительное титрирование включает в себя: аргентометрическое титрование, меркуриметрию и меркурометрию.

Аргентометрия основана на реакциях осаждения галогенов раствором нитрата серебра (титрант) и может быть выполнена прямым и обратным методами. Эквивалентную точку при прямом методе устанавливают с помощью индикатора хромата калия (метод Мора) или с адсорбционными индикаторами (метод Фаянса). При обратном аргентометрическом титровании (метод Фольгарда) индикатором избыток нитрата серебра оттитровывают тиоцианатом аммония. Этот же химический процесс лежит в основе количественного определения серебра и известен под названием тиоцианатометрии или рода-нометрии. Обоими методами определяют неорганические лекарственные вещества — галогениды (хлориды, бромиды, йодиды), щелочные металлы, галогениды четвертичных аммониевых оснований (пента-мин) и соли галогеноводородных кислот (гидрохлориды, гидробромиды, гидройодиды), органических оснований (ганглерон, тримека-ин, ксикаин), в том числе алкалоидов (морфина гидрохлорид, пахи-карпина гидройодид).

Прямой метод используют для количественного определения йод-метилатов органических оснований (метацин), дийодметилатов (ди-тилин), йодэтилатов (кватерон). Этим же методом определяют сульфаниламиды, образующие соли серебра.

Обратной аргентометрией можно определить препараты натрия я-аминосалицилат, меркаптопурин, этоксид, образующие соли серебра.

Для аргентометрического определения органических веществ, содержащих галогены, связанные с органической частью молекулы, необходимо атомы галогенов предварительно превратить в ионы. При этом используют термические методы, а также щелочные или восстановительное дегалогенирование.

Меркуриметрия основана на образовании малодиссоциированных соединений ртути (II). Например, при взаимодействии нитрата ртути с хлорид-ионами получается малодиссоциированный дихлорид ртути. При титровании хлоридов в качестве индикаторов используют дифенилкарбазид или дифенилкарбазон. В эквивалентной точке они образуют сиреневого цвета комплексные соединения с ионом ртути (И), содержащимся в точке титранта.

Меркурометрия в отличие от меркуриметрии используют для определения анионов (в основном галогенидов), образующих малорастворимые соединения с катионами ртути (I), содержащимися в тит-ранте. При определении галогенидов в качестве индикаторов используют также бромфеноловый синий и дифенилкарбазон, но в отличие от кислотно-основного и меркуриметрического титрования они выполняют роль адсорбционных индикаторов (подобно эозина-ту натрия в аргентометрии).

Кроме выше перечисленных методов при осадительном титровании используют висмутометрию, пикриновую кислоту, определение по сульфат-иону.

Кислотно-основное титрование (метод нейтрализации) наиболее широко применяют в фармацевтическом анализе. Его используют для определения более 40% фармакопейных лекарственных веществ.

Титрование в водной среде заключается в том, что растворимые в воде вещества с кислотными свойствами титруют растворами гидроксида натрия, а вещества основного характера — растворами соляной или серной кислоты. В качестве индикаторов используют красители, изменяющие окраску в широком диапазоне рН — от 1,2 до 10,5. В фармакопейном анализе наиболее часто используют: метиловый оранжевый (3,1—4,4), метиловый красный (4,8—6,0), бромтимоловый синий (6,0—7,6), феноловый красный (6,4—8,0), фенолфталеин (8,2— 10,0) и тимолфталеин (9,4-10,6).

Ацидометрией определяют натриевые соли неорганических и органических кислот (натрия гидрокарбонат и тетраборат, калия ацетат, натрия бензоат, натрия салицилат, натрия л-аминосалицилат, кофеин-бензоат натрия и др.), используя в качестве титранта соляную кислоту, в том числе определяют соли барбитуратов.

Алкалиметрию используют для количественного определения лекарственных веществ, представляющих собой неорганические (соляная, борная) и органические (уксусная, лимонная, глутаминовая, аскорбиновая, никотиновая) кислоты, а также вещества сложной гетероциклической структуры, содержащие в молекуле карбоксильную группу (салюзид). Соли органических оснований (в том числе алкалоидов, витаминов) определяют по связанной соляной, азотной или фосфорной кислоте (хинозол, секуринина нитрат, пиридоксина гидрохлорид и др.). Щелочью также титрируют лактаты, гидротартраты органических оснований.

Иногда, например при определении препаратов ртути (II), используют косвенную нейтрализацию. Ртути оксид желтый, амихло- . рид и цианид под действием йодида калия образуют гидроксид калия или аммиак, которые затем титрируют соляной кислотой.

Формольное титрование (метод Серенсена). Первичные алифатические и ароматические аминокислоты и их соли (кислота амино-капроновая, калия и магния аспарагинаты, кислота глутаминовая, ПАСК-натрий), взаимодействуя с раствором формальдегида, образуют азометины. При этом происходит усиление кислотных свойств аминокислоты и ее титруют раствором гидроксида натрия с индикатором фенолфталеином, натриевые соли (ПАСК-натрий) титруют методом формольного титрирования в среде смешанных растворителей (смесь метанола и ацетона) с использованием индикатора тимолового синего.

Оксимный метод основан на нейтрализации эквивалентного количества соляной кислоты, выделившейся в результате взаимодействия гидроксиламина гидрохлорида с кетопроизводными. Метод применяют для определения бициклических терпенов (камфора) и стероидных соединений, содержащих в молекуле кетогруппу.

Косвенное определение алкалоидов теобромина и теофиллина проводят реакцией осаждения ионами серебра, сопровождающейся выделением эквивалентного количества азотной кислоты, которую затем выявляют алкалиметрическим методом. Аналогичный принцип лежит в основе определения мерказолина.

Титрование в смешанных растворителях, состоящих из воды и органических растворителей, проводят тогда, когда препарат плохо растворим в воде или водные растворы имеют слабо выраженные кислотные (щелочные) свойства. Так, при алкалиметрическом титровании плохо растворимых в воде органических кислот (ацетилсалициловой, салициловой, бензойной, цинхофена) растворителем служит спирт, а титрантом — водный раствор гидроксида натрия. Смешанные растворители (спирт-вода или ацетон-вода) используют для алкалиметрического титрования сульфаниламидов. Не смешивающиеся между собой растворители (воду и хлороформ) сочетают при определении некоторых солей органических оснований — производных я-аминобензойной кислоты.

Титрование в среде неводных растворителей (неводное титрование) применяют для веществ, обладающих кислотными и основными свойствами, но трудно растворимых в воде. При этом можно осуществлять выбор неорганического растворителя, который способен изменять силу кислотных или основных свойств вещества. В качестве тит-рантов используют растворы сильных кислот и оснований. Метод требует наличия герметизированной титровальной установки.

Неводное титрование органических оснований (и их солей) выполняют, используя в качестве растворителя безводную уксусную кислоту с уксусным ангидридом. Титрантом служит раствор уксусной кислоты, а индикатором — раствор кристаллического фиолетового, тропеолина 00 или метилового оранжевого. Хлорной кислотой в неводной среде титруют соли сильных оснований и слабых кислот (калия ацетат). По этой схеме можно оттитровать многие лекарственные вещества основного характера (производные пиразолона — амидопирин; пиридина — никотинамид, фтивазид; основания различной структуры — адреналин, норадреналин, гидротартраты, нит-ранол, хингамин, трихомонацид, нафтамон и др.). Исключение составляют галогениды четвертичных аммониевых оснований и соли галогеноводородных кислот (гидрохлориды, гидробромиды, гидройо-диды органических оснований). Поэтому галогеноводороды титруют в присутствии ацетата ртути (II) или в качестве растворителей используют смесь муравьиной кислоты и уксусного ангидрида 1:20.

Неводное титрирование органических веществ, проявляющих кислотные свойства, выполняют, используя обычно в качестве растворителя диэтил форм амид или его смесь с бензолом, а также этилен-диамин, бутиламин, пиридин. Титрантом служит раствор гидроксида натрия в смеси метилового спирта и бензола или раствор метилата натрия (лития), индикатор — тимоловый синий. Определяют фенолы, карбоновые кислоты, аминокислоты, сульфаниламиды, барбитураты, производные тиоурацила и др. Барбитал, фенобарбитал, фталазол титрируют в среде диметилформамида раствором гидроксида натрия, а вещества с более слабо выраженными кислотными свойствами (фенолы) — раствором метилата натрия.

Окислительно-восстановительное титрирование предусматривает использование йодометрии, йодхлорометрии, броматомет-рии, дихроматометрии, перманганатометрии, периметрии.

Йодометрия основана на использовании окислительных свойств свободного йода и восстановительных свойств йодид-ионов. Этим методом определяют количество органических и неорганических веществ, способных окисляться или восстанавливаться, а также образовывать с йодидом продукты замещения. Индикатором служит крахмал, образующий с йодидом соединение, окрашенное в синий цвет (определяют: натрия тиосульфат, препараты мышьяка (Ш), хлоралгидрат, формальдегид, фурацилин, метионин, анальгин и др.).

Йодометрию используют для определения фтивазида, апрессина и кислоты аскорбиновой. Происходит процесс окисления веществ титрованным раствором йодата калия. Избыток титранта устанавливают йодометрическим методом.

Вещества, образующие осадки, — полийодиды также можно опреде- -лять этим методом: ряд алкалоидов (хинина гидрохлорид, папаверина гидрохлорид, кодеин, кофеин, кокаина гидрохлорид, пахикарпина гид-ройодид), витаминов (тиамина бромид), гетероциклические основания и их соли (хинозол, спазмолитин, дипрофен, дибазол, карбахолин, ква-терон, амидопирин), четвертичные аммониевые соли (прозерин) и др.

Иодхлорометрия — метод аналогичный йодометрии, но отличается тем, что в качестве титранта используют раствор йодмонохлорида, обладающего большей устойчивостью. По ГФ этим методом определяют этакридина лактат. Также можно определять фенолы, сульфаниламиды, производные я-аминобензойной кислоты и другие первичные ароматические амины.

В броматометрии в качестве титранта используют бромат калия, проявляющий в кислой среде окислительные свойства. Определение обычно ведут в присутствии бромида. Индикаторами служат красители из азосоединений (метиловый красный и оранжевый), которые окисляются и обесцвечиваются под действием избытка титранта после достижения эквивалентной точки. Этим методом определяют неорганические соединения мышьяка и элементоорганические, но после предварительной минерализации. При количественном определении производных фенолов (фенол, тимол, резорцин, салициловая кислота) и первичных ароматических аминов используют метод обратной броматометрии. Вьщеляющийся бром (в присутствии бромида) расходуется на галогенирование фенолов или аминов, образуя ди- или трибром-производные. Избыток брома определяют йодометрическим методом.

На основе бромат-бромидной реакции разработаны методы кинетического определения фенола, фентоламина гидрохлорида, карби-дина, апрессина, производных я-аминобензойной кислоты в готовых лекарственных формах.

Дихроматометрия — метод, основанный на осаждении титрованным раствором дихромата калия некоторых солей органических оснований (метиленовый синий, акрихин). Нерастворимые дихроматы оснований отфильтровывают, а избыток титранта определяют йодометрическим методом.

Перманганатометрия основана на использовании перманганата калия (титрант) в сильнокислой среде. При прямом титрировании индикатором является сам титрант, избыток которого придает раствору розовое окрашивание. Прямым титрованием определяют железо, восстановленное и пероксид водорода. Натрия нитрит определяют обратным титрированием. Избыток титранта устанавливают йодометрически. Определение йодидов щелочных металлов и органически связанного йода в раде иодорганических веществ также можно произвести окислением перманганата калия в сернокислой среде до йодноватой кислоты с последующим ее титрованием йодометрическим методом. Этот способ имеет преимущества перед фармакопейным, основанным на восстановительной минерализации с аргенто-метрическим окончанием.

Цериметрия основана на использовании в качестве титранта солей церия (IV), которые в кислой среде восстанавливаются до церия (III). Индикаторами служат дифениламин или о-фенантролин (фе-роин). При обратном титрировании избыток титранта (сульфат церия) определяют йодометрически. Цериметрию используют в анализе как неорганических [железа (II), мышьяка], так и органических (углеводов, органических кислот, производных фенотиазина) лекарственных веществ, а также для определения викасола, токоферола ацетата и производных бензотиадиазепина (дихлотиазид). Преимущества метода — соединения церия (IV) обладают устойчивостью в титрированных растворах и не образуют промежуточных продуктов взаимодействия.

Комплексонометрия. Метод основан на образовании прочных, растворимых в воде комплексов катионов металлов с трило-ном Б — динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или другими комплексонами. Взаимодействие происходит в стехиометрическом соотношении 1:1 независимо от заряда катиона. Метод применяют для определения неорганических и элементоорга-нических лекарственных препаратов, содержащих ионы магния, калия, цинка, висмута, свинца, алюминия и др. Для визуального установления точки эквивалентности используют индикаторы, называемые металлоиндикаторами, представляющие собой органические красители, которые образуют с указанными ионами непрочные ярко окрашенные комплексы. В конце титрования комплексы разрушаются, меняя окраску в эквивалентной точке.

В ГФ металлоиндикаторами используют ксиленоловый оранжевый, хальконкарбоновую кислоту, хромовый темно-синий (кислотный хром темно-синий), эриохром черный Т (протравной черный II). Применяют прямое и обратное титрование.

Нитритометрия основана на реакциях первичных ароматических аминов с нитритом натрия, который используют в качестве титранта. Первичные ароматические амины образуют с нитритом натрия диазосоединения в кислой среде. Эквивалентную точку устанавливают с помощью внешних (йодкрахмальная бумага) и внутренних индикаторов (тропеолин 00, нейтральный красный, смесь тропеолина 00 с метиленовым синим) или потенциометрически (индикатор — платиновый электрод, а электрод сравнения — хлорсереб-ряный или насыщенный каломельный). Метод применяют для определения сульфаниламидов, производных л-аминобензойной кислоты (анестезин, новокаин, новокаинамид), л-аминосалициловой кислоты (натрия л-аминосалицилат), представляющих собой первичные ароматические амины, а также вторичные амины (дикаин).

Газометрический анализ имеет ограниченное применение в фармацевтическом анализе. Определяют газообразные вещества — кислород, циклопропан. Сущность определения кислорода заключается во взаимодействии его с поглотительным раствором, содержащим легкоокисляющийся медно-аммиачный комплекс. Опре- деление проводят на приборе Гемпеля, измеряя объем непрореагиро-вавшего газа (ГФ IX, с. 349). Аналогично определяют циклопропан (ГФХ, с. 228).

Количественный элементный анализ используютдля определения органических и элементоорганических соединений, содержащих азот, серу, галогены, а также мышьяк, висмут, ртуть, сурьму и другие элементы.

Фармакопейный метод определения азота в органических соединениях известен как метод Кьельдаля. Он основан на сочетании минерализации органического вещества с последующим кислотно-основным титрованием. Используют для анализа азотсодержащих органических веществ, а также лекарственных веществ, содержащих аминный, амидный и гетероциклический азот. Определение проводится в несколько стадий. Существует упрощенный вариант метода, исключающий минерализацию.

Метод сжигания в колбе с кислородом ~ перспективный в фармацевтическом анализе. Основан на разрушении органического вещества (сжигание в колбе с кислородом), растворении образовавшихся продуктов в поглощающей жидкости и последующим определении элементов, находящихся в растворе в виде ионов или молекул. Определение выполняют химическими или физико-химическими методами. Выявляют органические вещества, содержащие в молекуле галогены, серу, фосфор, азот и другие элементы. Преимущества метода — быстрота и отсутствие минерализации. ГФ рекомендует метод для определения йода в йодоорганических веществах. Однако исследования показывают, что он пригоден для определения многих других веществ.

Количественный элементный анализ галоген-, мышьяк- и ртутьсодержащих лекарственных веществ с предварительной минерализацией. ГФ рекомендует метод для определения йодосодержащих органических лекарственных веществ, основанный на минерализации и окислении образовавшегося иона йода в йодат-ион. Последний регистрируют, используя в качестве восстановителя йодит калия по общему принципу йодотометрии. Аналогично определяются галогены, мышьяк и ртуть.

Физические и физико-химические способы анализа. Эти методы приобретают все большее значение как недеструктивный анализ (без разрушения анализируемого объекта). Для его выполнения пригодны многие физические и физико-химические методы, такие, как оптические ЯМР-, ПРМ-, УФ- и ИК-спектроскопия, ГЖХ, ВЭЖХ и др. В фармацевтическом анализе эти методы классифицированы на следующие группы: оптические; основанные на поглощении излучения; основанные на испускании излучения; основанные на использовании магнитного поля; электрохимические; разделения; термические. Эти методы имеют ряд преимуществ перед химическими. Они основаны на использовании как химических, так и физических свойств веществ и в большинстве случаев отличаются экспрессивностью, возможностью унификации и автоматизации.

Оптические методы основаны на определении показателя преломления луча света в растворе испытуемого вещества (рефрактометрия), измерении интерференции света в растворе испытуемого вещества (интерферометрия), способности раствора вещества вращать плоскость поляризованного луча (поляриметрия).

Рефрактометрию используют для испытания подлинности лекарственных веществ, представляющих собой жидкости (диэтиламид никотиновой кислоты, метилсалицилат, токоферола ацетат), а также для внутриаптечного контроля лекарственных форм, в том числе двойных и тройных смесей.

Интерферометрический метод используют для анализа лекарственных препаратов, титрованных растворов и дистиллированной воды.

Поляриметрию применяют для анализа веществ, в молекуле которых имеется асимметричный атом углерода.

Помимо этих методов используют химическую микроскопию и др.

Методы, основанные на поглощении излучения (абсорбционные методы), используют свойства веществ поглощать свет в различных областях спектра.

Атомно-абсорбционная спектрофотометрия основана на использовании ультрафиолетового или видимого излучения резонансной чистоты. Поглощение излучения вызывается переходом электронов с внешних орбиталей атомов на орбитали с более высокой энергией. Объектами, поглощающими излучение, являются газообразные атомы, а также некоторые органические вещества. Сущность этого метода состоит в том, что через пламя, в котором распыляется анализируемый раствор, проходит резонансное излучение от лампы с полым катодом. Это излучение попадает на входную щель монохрома-тора, причем из спектра выделяется только резонансная линия испытуемого элемента. Расчет концентрации производят с помощью специального уравнения. Имеются специальные атомно-абсорбционные спектрометры.

Ультрафиолетовая спектрофотометрия — наиболее простой абсорбционный метод анализа. Он разработан для анализа многих лекарственных веществ, методики которых изложены в различных НТД и ГФ XI.

Дифференциальные методы позволяют расширить область применения фотометрии в фармацевтическом анализе. Например, сущность метода дифференциальной спектрофотометрии и фотоколориметрии, включенного в ГФ XI, вып. I, с. 40, состоит в изменении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество испытуемого вещества.

Фотоколориметрический метод широко применяют в фармацевтическом анализе. В отличие от УФ-спектрофотометрии определение в этом случае осуществляют в видимой области спектра, при этом вещество с помощью какого-либо реагента переводят в окрашенное соединение, а затем измеряют интенсивность окраски раствора в фотоколориметре. Метод включен в НТД для количественного определения ряда нитропроизводных (нитроглицерина, фурадонина, фуразолидона), а также витаминов (рибофлавина, фолиевой кислоты) и сердечных гликозидов (целанида). Разработаны многочисленные методики фотоколориметрического определения препаратов в лекарственных формах.

Кроме того, в фармацевтическом анализе используют фототурбодиметрию и фотонефелометрию, хронофототурбодиметрию, термонефелометрию и инфракрасную (ИК) спектроскопию и их различные модификации.

К методам, основанным на испускании излучения, относят фотометрию пламени, флуоресцентные и радиохимические методы.

Эмиссионная и пламенная спектрометрия включена в ГФ XI для качественного и количественного определения химических элементов и их примесей в лекарственных веществах. Измерение интенсивности излучения спектральных линий испытуемых элементов выполняют на пламенных фотометрах. Регистрирующими системами служат фотоэлементы, связанные с цифровыми и печатающими устройствами. Точность определения этими методами находится в пределах 1—4% , предел обнаружения может достигать 0,001 мкг/мл.

Люминесцентные методы основаны на измерении вторичного излучения, возникающего в результате воздействия света на анализируемое вещество. К их числу относят флуоресцентные методы, хе-милюминесцентные методы, рентгенофлуоресценцию и др., для чего используют ряд приборов, например спектрофлуориметры, сравнивая на них показания испытуемых образцов со свидетелями (эталонными образцами).

К методам, основанным на использовании магнитного поля, относятся ЯМР- и ПМР-спектроскопии, масс-спектроскопия, отличающиеся высокой специфичностью, чувствительностью и возможностью анализировать многокомпонентные смеси, в том числе лекарственные формы без предварительного их разделения. При использовании данных методов подлинность лекарственных веществ может быть подтверждена либо по полному набору спектральных параметров, характеризующих структуру данного соединения, либо по наиболее характерным сигналам спектра. Подлинность можно установить с помощью стандартного образца, добавляя его количество к анализируемому раствору. Полное совпадение спектров анализируемого вещества и его смеси со стандартным образцом указывает на их идентичность. В специальных аннотациях изложены правила работы со спектрофотометрами и другой аппаратурой, используемой для этих методов, а также указаны лекарственные вещества, которые можно определять ими.

Электрохимические методы анализа основаны на электрохимических явлениях, происходящих в исследуемой среде и связанных с изменениями химической структуры, физических свойств или концентрации веществ.

Потенциометрия основана на измерении равновесных потенциалов, возникающих на границе между испытуемым раствором и погруженным в него электродом (ГФ XI, вып. 1, с. 121).

Амперометрическое титрирование с двумя индикаторными электродами, или титрирование «до полного прекращения тока», основано на использовании пары идентичных инертных электродов (платина, золото), которые находятся под небольшим напряжением. Часто используют для нитритойодометрического титрования. Точку эквивалентности находят по резкому увеличению силы тока, проходящего через ячейку (в течение 30 с) после добавления последней порции реагента (ГФ XI, вып. 1, с. 123). Разновидностью этого метода является ионометрия с использованием ионоселективных электродов.

Полярография — метод анализа, основанный на измерении силы тока, возникающего на микроэлектроде при электровосстановлении или элек-троокислении анализируемого вещества в растворе. Электролиз проводят в полярографической ячейке, которая состоит из электролизера (сосуда) и двух электродов. Используют методы калибровочных кривых, стандартных растворов и добавок (ГФ XI, вып. 1, с. 154).

Кроме того, из электрохимических методов можно использовать кондуктометрию, кулонометрию и метод диэлектрических измерений.

К методам разделения, которые часто используют в фармацевтическом анализе, относятся хроматография, электрофорез и экстракция.

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной — твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом носителе. Отношение скорости перемещения вещества к скорости перемещения растворителя обозначают Rf. Эта величина — константа вещества для данных условий разделения и используется для идентификации. Хроматофафия дает возможность наиболее эффективно осуществлять избирательное распределение компонентов анализируемого вещества (очень важно при исследовании смеси из нескольких веществ). По механизму процесса разделения хроматофа-фические методы классифицируют на ионообменную, адсорбционную, осадочную, распределительную, окислительно-восстановительную хроматографию. По форме проведения процесса выделяют колоночную, капиллярную и плоскостную хроматографию. Подробное описание приборов и методик изложено в ГФ XI, вып. I, с. 98 и другой НТД.

К данным методам относят и газожидкостную (газовую) хрома-тофафию (ГЖХ), основанную на распределении вещества между газовой и жидкой или твердой фазами, а также жидкостную хромато-фафию (ЖХ), отличающуюся от газовой тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость. Вариантом последней ЖХ является высокоэффективная жидкостная хроматофафия (ВЭЖХ), которую называют также жидкостной хроматофафией высокого давления.

Широкое применение при анализе получила хроматофафия в тонком слое сорбента (ТСХ, ГФ XI, вып. 1, с. 102), отличающаяся от хроматофафии на бумаге тем, что процесс, протекающий при перемещении подвижной фазы, происходит на сорбенте, нанесенном тонким слоем на инертную поверхность, чем достигается высокая чувствительность, простота использования и устойчивость к температурным и химическим воздействиям.

Иногда для идентификации ряда лекарственных веществ сочетают ТСХ с ИК-спектроскопией, УФ-спектроскопией и другими методами и их модификациями.

Электрофорез на бумаге и в тонких слоях сорбента по технике выполнения и аналитическим возможностям сходен с ТСХ. В ГФ XI включен электрофорез, как метод анализа, основанный на способности перемещения заряженных частиц в электрическом поле и их регистрации. Различают фронтальный, зональный электрофорез, иммуноэлектрофорез и метод пептидных карт (сочетание бумажной и тонкослойной хроматофафии с высоковольтным электрофорезом).

Термические методы анализа. В зависимости от природы веществ, температуры и условий нафевания в них могут происходить химические превращения, структурирование, термическая, окислительная или гидролитическая деструкция. Термическая деструкция сопровождается поглощением или выделением теплоты, а также выделением газов, которые можно фиксировать.

Термография позволяет оценить термическую стабильность по температурам термоэффекта связанного с деструкцией вещества, поэтому термический анализ находит применения в фармацевтической химии.

Термический анализ основан на точной (до 0,1 °С) регистрации равновесного состояния между кристаллической и жидкой фазами анализируемого вещества. Основные недостатки этого метода: невозможность использования для исследования термолабильных веществ; значительные затраты времени; отсутствие должной воспроизводимости. Существует несколько модификаций метода: термомикроскопический метод; дифференциальный термический анализ; дериватогра-фия; дифференциальная сканирующая колориметрия; метод дифференциальной микроколориметрии, термофрактография и др.

Биологические методы анализа. Биологический контроль качества лекарственных средств обычно проводят по силе фармакологического эффекта или токсичности. Эти методы применяют тогда, когда с помощью химических, физических или физико-химических методов не удается сделать заключение о чистоте или токсичности препарата или когда способ получения препарата не гарантирует постоянства активности (например, антибиотики). Биологические испытания проводят на животных (мыши, крысы, кролики, морские свинки, а также кошки, собаки, лягушки), отдельных изолированных органах (рог матки, часть кишки, кожа), отдельных группах клеток (культура клеток, форменные элементы крови) и на определенных сероварах микроорганизмов. Активность ряда препаратов при этом выражают в единицах действия (ЕД), например, при определении гликозидов, антибиотиков и др.

Биологический контроль на сердечные гликозиды проводят как растительного сырья, так и самих препаратов (ГФ XI), например, разных видов наперстянки, горицвета, ландыша, строфанта, желтушника. Испытания проводят на лягушках, кошках и голубях, устанавливая соответственно лягушачьи (ЛЕД), кошачьи (КЕД) и голубиные (ГЕД) единицы действия. Одна ЛЕД соответствует дозе стандартного образца, вызывающей в условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства подопытных стандартных лягушек (самцы массой 28—33 г). Одна КЕД или ГЕД соответствует дозе стандартного образца или испытуемого препарата из расчета на 1 кг массы животного, в том числе птицы, также вызывающего систолическую остановку сердца кошки или голубя. Содержание ЕД рассчитывают в 1 г растительного сырья или сухих концентратов, в одной таблетке или в 1 мл (в жидких лекарственных формах).

Испытание на токсичность проводят согласно ГФ XI, вып. 2, с. 182, для чего отбирают по два флакона или две ампулы от каждой серии, содержащей не более 10 000 ед. Из партий большего количества отбирают по 3 ампулы (флакона) от каждой серии. Содержимое отобранных проб одной серии смешивают и испытывают на здоровых белых мышах (массой 19—21 г). Раствор вводят в хвостовую вену пяти мышам и наблюдают за ними 48 ч. Препарат считается выдержавшим испытания, если в течение указанного времени не погибнет ни одна мышь. Если погибнет хоть одна мышь, испытание повторяют по определенной схеме. В статьях НТД указаны дозы введения раствора для каждого препарата. При повторении отрицательных результатов партия бракуется.

Испытания на пирогенность. Пирогенную реакцию (повышение температуры тела) вызывают живые и мертвые микроорганизмы (чаще грамотрицательные). Допустимо содержание, например, в изотоническом растворе натрия хлорида 10 микроорганизмов в 1 мл, а при введении не более 100 мл допускается 100 микроорганизмов в 1 мл. Испытанию на пирогенность подвергают воду для инъекций, инъекционные растворы, иммонобиологические лекарственные средства, растворители, используемые для приготовления инъекционных растворов, а также лекарственные формы, вызывающие пирогенную реакцию.

В ГФ XI включен биологический метод испытания на пирогенность, основанный на измерении температуры тела кроликов после введения в ушную вену испытуемых стерильных жидкостей. Отбор проб ведется так же как при испытании на токсичность (ГФ XI, вып. 2, с. 183-185).

Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех трех кроликов не превышает или равна 1,4 "С. Если сумма температур превышает 2,2 °С, то жидкость считают пирогенной, если меньше 2,2 °С, то дальнейшее испытание проводят уже на восьми кроликах. Жидкость считают непиро-генной, если сумма повышения температур у всех восьми кроликов не более 3,7 "С.

В последнее время для определения пирогенности испытывают различные физические и физико-химические методы, например спек-трофотометрию, полярографию и др.

На содержание веществ гистаминоподобного действия испытывают парентеральные лекарственные средства на взрослых кошках. Методика испытания подробно описана в НТД.

Микробиологический контроль проводят для нестерильных лекарственных средств (испытание на микробиологическую чистоту) и средств для парентерального введения (испытание на стерильность). В ГФ XI, вып. 2, с. 187, 193 подробно описаны данные методики. Следует подчеркнуть исключительную важность проведения данных определений, поскольку они имеют жизненно важные интересы.

Стандартные образцы— это вещества, с которыми сравнивают испытуемые лекарственные средства при проведении их анализа физико-химическими или биологическими методами. Их условно подразделяют на химические и биологические, но это не исключает использование их для различных методов как физико-химического, так и биологического анализа. В ГФ XI, вып. 2, с. 60 даны определения терминов «государственные стандартные образцы» (ГСО), «рабочие стандартные образцы» (РСО) и «стандартные образцы веществ-свидетелей» (СОВС). Активность или содержание вещества в процентах в ГСО принимается за 100, если нет других указаний на этикетке. Выпуск ГСО осуществляют с требованиями ФС, которая разрабатывается и пересматривается предприятием-разработчиком. В качестве РСО используют образцы серийных лекарственных веществ, которые соответствуют требованиям ФС. Расчет количественного содержания препарата в лекарственной форме проводят по сравнению с РСО. В качестве СОВС используют ГСО, РСО и вещества, специально изготовленные в порядке, предусмотренном частной ФС. Некоторые особенности имеют стандартные образцы на антибиотики. При изготовлении стандартов для многокомпонентных антибиотических средств, используют субстанции, соответствующие отдельным компонентам.

Аттестацией, хранением и реализацией стандартных образцов занимается ГНИИСКЛС. Такие стандартные образцы имеются для многих лекарственных веществ. Ряд аналогичных ветеринарных стандартных препаратов находится в ВГНКИ ветпрепаратов, позволяющих более объективно проводить идентификацию (качественную и количественную) лекарственных препаратов. В отличие от медицины, где условия анализа препарата излагаются в ФС, в ветеринарии эти сведения излагаются в ТУ, без которых не должен внедряться ни один новый лекарственный препарат.