Биохимические дифференциально-диагностические тесты

3.2.4 Биохимические дифференциально-диагностические тесты

При невозможности идентифицировать штаммы, основываясь только на их морфологических особенностях, применяют тесты для определения некоторых проявлений метаболической активности грибов. Для лабораторной практики разработаны методы определения питательных потребностей и методы определения ферментативной активности дерматофитов.

Определение потребности в источниках питания и витаминах.

Основную минимальную среду (NH4NO3 1,5 г, глюкоза 40 г; MgS04 • 7НгО 0,5 г; КН2РС>4 1 г; агар Дифко 20 г; дистиллированная вода до 1000 мл) растворяют при нагревании и автоклавируют при 0,5 атм 15 мин. Витамины (тиамин 1 мг, i-инозит 250 мг, L-гистидин 150 мг, никотиновая кислота 10 мг) растворяют в 100 мл дистиллированной воды каждый, автоклавируют при 0,5 атм 15 мин и хранят в холодильнике. Перед опытом 2 мл того или иного витамина добавляют к 100 мл остывающей основной среды. Для определения способности ассимилировать углеводы их вносят в основную среду вместо глюкозы до конечной концентрации 1 %. Источники азотистого питания вносят в среду вместо NH4NO3. Контролем служат посевы на основную и обогащенную среду.

Кератинолитическая активность (Тест перфорации волос).

А) Мелко раздробленную очищенную почву стерилизуют в автоклаве 3 дня подряд по 1 часу при 1 атм. и помещают в чашки Петри ровным слоем в 3-4 мм. На поверхности почвы равномерно и не густо распределяют нарезанные на короткие фрагменты (15-20 мм) детские волосы, простерилизованные в автоклаве 2 дня подряд по 20 мин при 1 атм. На поверхность почвенно-волосяной среды наносят взвесь исследуемой культуры в 1-2 мл дистиллированной воды. Посевы инкубируют 4 недели при 22-27° с еженедельным увлажнением среды стерильной дистиллированной водой. Наличие органов-перфораторов или других форм кератиноли-зиса регистрируют путем еженедельной микроскопии волос, на которых происходит развитие культуры гриба.

Б) Полоску фильтровальной бумаги помещают на дно стерильной чашки Петри и покрывают стерильной дистиллированной водой. Вносят нарезанные стерилизованные волосы, 5-6 капель 1 % дрожжевого экстракта и взвесь исследуемой культуры. Инкубируют при 25° 4 недели. Еженедельно микроскопируют волосы на наличие конических органов - перфораторов волосяного стержня. Данный метод применяют для дифференциации Т. equinum, T. raentagrophytes, T. rubrum, a также для получения совершенных форм дерматофитов из почвы.

Дифференциальная среда с молоком, глюкозой и бромкрезол - пурпурным (ВСР + CCG + 0,5 % дрожжевого экстракта) позволяет дифференцировать виды дерматофитов по двум параметрам: за-щелачивание среды (голубая —> пурпурная) и зона просветления вокруг колоний за счет гидролиза молока.

Гемолитическую активность определяют на среде Сабуро рН 6,5 с фосфатным буфером и с 5 % дефибринированной бараньей крови. Эритроциты вносят в остывающий агар, и среду разливают по чашкам достаточно толстым слоем. После посева исследуемых культур чашки инкубируют 2 недели при 27°. О гемолитической способности судят по образованию вокруг колоний зоны просветления вследствие растворения эритроцитов. Зеленоватую окраску этой зоны расценивают как альфа-гемолиз, наличие прозрачной и бесцветной зоны -как бета - гемолиз. Контролем служат незасеянные чашки с 5 % кро-ч вяным агаром. Тест может служить для дифференциации Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также Т. tonsurans и Т. soudanense.

Определение уреазной активности (способности расщеплять мочевину) производят на среде Христенсена с мочевиной. Состав среды: пептон 1 г, NaCl 5 г, КН2РО4 2 г, глюкоза 5 г, агар 20 г, дистиллированной воды до 1000 г. Ингредиенты среды растворяют при нагревании, рН доводят до 6,8 и добавляют 6 мл 0,2 % раствора фенол красного (0,2 г фенолрота растворяют в 20 мл нагретого этанола и прибавляют 80 мл нагретой дистиллированной воды). Среду стерилизуют 20 мин при 0,5 атм, охлаждают до 50° и добавляют 100 мл водного раствора мочевины (стерилизованного через бактериальный фильтр или 15 мин при 0,5 атм). Среду разливают в пробирки, скашивают и посевы инкубируют 7 дней при 25°-30°. Результаты оценивают по наличию и сроку появления красного окрашивания среды, которое является показателем уреазной активности культур. Контролем служат незасеянные пробирки со средой. Тест применяют для дифференциации атипичных штаммов Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также для идентификации Т. gallinae, «африканских» трихофитонов и некоторых видов Microsporum.

Инкубация параллельных посевов при t 25°-30°-37° на скошенном агаре Сабуро. Используется для дифференциации Т. men-tagrophytes и Т. terrestre, а также Т. verrucosum и Т. schonleinii.

IV. Серологические и аллергологические исследования

4.1. Серологические тесты: реакция преципитации в варианте иммунодиффузии в агаровом геле

Сыворотка пациента вносится в центральную лунку, сделанную в агаровом геле, и антигены культур различных видов вносятся в окружающие лунки. Результаты учитываются через 48 и 72 часа инкубации при комнатной температуре и затем через 2-3 дня в холодильнике. Для проверки специфичности линий преципитации в центральную лунку вносится капля 1,5 % ЭДТА, и через 1 час неспецифические линии преципитации исчезают.