Колориметрические методы 0. Гемоглобин колориметрируют

1.  Колориметрические методы 0. Гемоглобин колориметрируют

как оксигемоглобин или редуцированный гемоглобин или же сперва

превращают его в цветные производные (солянокислый гематин,

щелочной гемоглобин, метгемоглобин, карбоксигемоглобин,

циангемоглобин, азид-метгемоглобин и пр.).

Сюда можно отнести и первый метод для определения

гемоглобина, предложенный Велькером в 1854 году и

модифицированный Тальквистом, при котором цвет капли крови на

фильтровальной бумаге сравнивают с серией цветных бумажных

стандартов.

На основании превращения гемоглобина в солянокислый

гематин и связанных с этим изменений в электрической

проводимости, Неллер предложил электронный метод определения

концентрации гемоглобина.

2.   Газометрические методы . Гемоглобин насыщают газом,

например кислородом, окисью углерода (СО). По количеству

поглощенного газа судят о количестве гемоглобина. Количество

кислорода устанавливают прибором ван-Слайка, прибором

Баркрофта или каким-нибудь другим аппаратом для определения

кислорода.

3. Методы, основанные на  определении железа в

 гемоглобиновой молекуле 0. Так как гемоглобиновая молекула

содержит точно определенное количество железа (0,0347%), по

его количеству устанавливается и количество гемоглобина.[6]

 _МЕТГЕМОГЛОБИН

Метгемоглобин - производное гемоглобина, в котором

двухвалентный атом железа переходит в трехвалентный. При

процессах обмена в эритроцитах всегда образуются известные

количества метгемоглобина, который, однако, восстанавливается

обратно в гемоглобин под воздействием фермента

метгемоглобинредуктазы, так что в цельной крови здорового

человека метгемоглобин не превышает 2% общего содержания

гемоглобина (0,03-0,3 г%).[7]

 _СУЛЬФОГЕМОГЛОБИН

Химическая структура сульфогемоглобина не выяснена.

Вероятно, две виниловые группы гемоглобина соединяются,

посредством SО2-мостиков, с соседними метиновыми связями. В

норме, сульфогемоглобина в крови нет. Он появляется при

отравлениях соединениями сурьмы, фенацитином, бромом,

сульфонамидами, нитратами (колодезная вода), серными

соединениями и пр.

Определение сульфогемоглобина в крови можно произвести

спектроскопически. Сульфогемоглобиновый спектр не изменяется

от прибавления сульфида аммония, но исчезает от прибавления

Na2S2О4 и 2 мл 10% едкого натра, или нескольких капель 3%

перекиси водорода.

 _ТИПЫ ГЕМОГЛОБИНА

Недавно еще считалось, что гемоглобин взрослого человека

представляет собой одно единственное соединение. Известно было

только то, что в эмбриональной жизни имеется особенный тип

гемоглобина, называемый HbF, в 155 раз более устойчивый к n/12

натриевой щелочи, чем нормальный гемоглобин. В последнее

время, благодаря работам Полинга и его сотрудников и др.,

выяснилось, что гемоглобин взрослого человека и при

нормальных, и при патологических состояниях не представляет

собой гомогенного химического соединения. Открыто было много

нормальных и патологических типов гемоглобина, которые

представили в новом свете обмен гемоглобина и указали пути для

исследования патогенеза некоторых анемий. Установлено было,

что при некоторых заболеваниях наблюдаются особые типы

гемоглобина, характерные для данной анемии. Типы гемоглобина

имеют большое значение не только для диагноза, но и перемежают

вопрос о патогенезе анемии из чисто морфологической области в

биохимическую. Анемии, вызванные появлением патологического

типа гемоглобина, называются гемоглобинопатиями или

гемоглобинозами.

Выяснилось, что у человека имеются три основных  типа

 нормального гемоглобина:  эмбриональный  U ,   фетальный - F  и

гемоглобин  взрослого человека - А. HbU (назван по начальной

букве слова uterus) встречается в эмбрионе между 7 и 12

неделями жизни, затем он исчезает и появляется фетальный

гемоглобин, который после третьего месяца является основным

гемоглобином плода. Вслед за этим появляется постепенно

обыкновенный гемоглобин взрослого человека, называемый Hb A,

по начальной букве английского слова "adult". Количество

фетального гемоглобина постепенно уменьшается, так что в

момент рождения 80% гемоглобина представляет собой Hb A и

только 20% - HbF. После рождения фетальный гемоглобин

продолжает убывать и к 2-3 году жизни составляет всего 1-2%

(рис.15). Тоже количество фетального гемоглобина и у

взрослого. Количество HbF, превышающее 2% считается патологическим для взрослого человека и для детей старше 3

лет.

Кроме нормальных типов гемоглобина в настоящее время

известно свыше 50 его патологических вариантов. Они сначала

были названы латинскими буквами. Буква В в обозначениях типов

гемоглобина отсутствует, т.к. ею обозначен первоначально Hb S.

Вскоре выяснилось, что букв азбуки не хватит для

обозначения всех патологических типов гемоглобина. Поэтому

стали применять для этого имена пациентов, больниц,

лабораторий, названия мест и округов. Самой удобной является

номенклатура по структурной формуле (см. ниже).

Как нормальные, так и патологические типы гемоглобина

различаются не по структуре протопорфиринового кольца, а

построению глобина. Разница может заключаться в изменении

целых пар полипептидных цепей в гемоглобиновой молекуле, или

при сохранении тех же полипептидных цепей, замещаются на

определенном месте в первичной структуре одна аминокислота

другой.

 Первая возможность  встречается у гемоглобинов H, F, Бартс,

А2 и U. Вместо нормальной структуры гемоглобина А -

альфа-альфа/бета-бета, соответственно альфа2/бета2 ,

гемоглобин Н имеет структуру бета-бета-бета-бета,

соответственно бета4, что значит, что по обе

альфа-полипептидные цепи замещены новыми двумя

бета-полипептидными цепями. У гемоглобинов F, Бартс и А2

появляются две новые цепи, обозначаемые гамма и дельта, а у

гемоглобина U новая цепь, обозначаемая ипсилон. Структура HbF

альфа-альфа/гамма-гамма, соответственно альфа2/гамма2,

структура гемоглобина Бартс гамма-гамма-гамма-гамма, соотв.

гамма4, структура HbА2 альфа-альфа/дельта-дельта,

соответственно альфа2/гамма2, структура гемоглобина U -

альфа-альфа/ипсилон-ипсилон, соответственно альфа2/ипсилон2.

Патологические гемоглобины, которые состоят из четырех

одинаковых полипептидных цепей, обозначают тетрамерами.

Тетрамеры альфа4 и дельта4 до сих пор in vivo не наблюдались.

 Вторая возможность  встречается у большинства типов

гемоглобина. Так например единственная разница между HbS и HbA

состоит в том, что на 6-ом месте в бета-полипептидной цепи

вместо глутамина находится валин, единственная разница между

HbI и HbA в том, что на 16-ом месте в альфа-полипептидной цепи

лизин замещен аспарагиновой кислотой. На рис. 16 даны рад

других подобных примеров.

Когда аномалия состоит в замещении аминокислоты в

альфа-полипептидной цепи, то говорят об альфа-аномалии, когда

состоит в бета-полипептидной цепи - о бета-цепной аномалии,

когда в гамма-полипептидной цепи - о гамма-цепной аномалии

(патологические варианты HbF) и когда в дельта-цепи - о

дельта-цепной аномалии (патологические варианты HbA2).

При изучении гемоглобиновых типов имеет большое значение

вопрос о структуре глобинов. С одной стороны, структура

является самым верным способом отдифференцирования отдельных

типов гемоглобина один от другого, с другой стороны создается

возможность для составления строго научной номенклатуры

последних.

 _МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВИДОВ ГЕМОГЛОБИНА

1. Для разграничения отдельных типов человеческого

гемоглобина пользуются  электрофорезом  на блоке крахмала, на

крахмальном геле, на геле агара, на целлюлозно-ацетатных

листах, на акриламидном геле, на карбоксиметилцеллюлозном

геле, электрофорезом при высоком напряжении тока.