Гемоглобин эритроцитарных мембран человека

содержание

 

1. ВВЕДЕНИЕ. 3

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 6

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материал исследования. 29

3.2. Методы исследования. 29

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Количественное содержание гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов человека. 34

4.2. Взаимное варьирование количественной представительности отдельных белков эритроцитов человека. 36

4.3. Обсуждение. 39

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 40

6. ВЫВОДЫ.. 41

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.. 42

Введение

Мембрана эритроцита в течение долгого времени представлялась исследователям лишь оболочкой, отделяющей гемоглобин от плазмы. Роль мембраны в функционировании этой высоко специализированной клетки, казалось, ограничивается только способностью быть проницаемой для газов крови. Однако успехи, достигнутые в мембранологии за последние годы и, в частности, изучении мембраны эритроцита млекопитающих с помощью биохимических и биофизических методов, заставляют в настоящее время по-иному взглянуть на роль мембраны в работе клетки. Совокупность имеющихся в литературе данных позволяет сделать вывод о том, что плазматическая мембрана эритроцита – важнейший элемент клетки; она одновременно является и механической оболочкой с регулируемыми физическими свойствами, и "диспетчерской" клетки, осуществляющей координацию работы клетки в зависимости от физических и химических сигналов, поступающих к ней в организме. [9]

Важнейшие компоненты биологических мембран – белки, которые осуществляют их специфические функции. Одни из них обеспечивают транспорт определенных молекул внутрь клетки или из нее, другие являются ферментами и катализируют ассоциированные с мембраной реакции, третьи осуществляют структурную связь цитоскелета с внеклеточным матриксом или служат в качестве рецепторов для получения и преобразования химических сигналов из окружающей среды. Мембранные белки, образующие цитоскелет, соединяются друг с другом специфическим для каждого типа клеток образом и формируют сложные динамически взаимодействующие между собой структуры. Эти структуры и отвечают непосредственно за согласованное поведение частей клеток. [4] Гемоглобин можно считать своего рода модельным белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Десятки лет исследований гемоглобина во многих лабораториях мира привели к значительному прогрессу в описании и понимании физических, химических и биологических аспектов его функционирования. [2] Однако, несмотря на это, в научной литературе недостаточно подробно освещен вопрос о связи гемоглобина со структурными белками эритроцитарных мембран.

Изучение структуры мембраны эритроцита человека и прежде всего входящих в их состав белков является актуальным, поскольку ряд наследственных патологий (сфероцитарные анемии, миодистрофии, некоторые заболевания центральной нервной системы) характеризуются различными нарушениями в белковой компоненте эритроцитарной мембраны и как следствие нарушением ее структурно-функциональной организации. [7] Определенные факторы среды могут изменять экспрессию генов, что отражается на жизнедеятельности как отдельных органов и систем, так и организма в целом. Некоторые авторы рассматривают уровень гемоглобина в крови как универсальный неспецифический показатель адаптационных процессов, процессов напряженности организма в ответ на различные внешние воздействия. [1] Так, следствием действия таких факторов может явиться уменьшения количества гемоглобина в крови или нарушения структурно-функциональной организации белковой компоненты мембран эритроцитов. Результатом таких изменений служит ряд патологий, и, как следствие, - значительное снижение адаптационных возможностей человека. Поэтому на сегодняшний день актуально изучение структуры мембрансвязанного гемоглобина, оценка его количественного содержания и взаимосвязь со структурными белками эритроцитарных мембран. В связи с начавшимся систематическим изучением продуктов экспрессии генов человека в рамках молекулярно-анатомического направления представляется крайне важным установление количества и основных свойств полипептидов, входящих в состав мембраны эритроцита, и составление каталога белков. Возможности этих исследований, а также поиска первичного биохимического дефекта при наследственных аномалиях существенно возросли после широкого распространения метода двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). [7]

Целью настоящего исследования явилось изучение количественного содержания мембраносвязанного гемоглобина эритроцитов человека и его связи со структурными белками.

литературный обзор

В силу своей специализации (перенос кислорода от легких к тканям) эритроцит по механическим свойствам является уникальной клеткой, так как в отличие от других клеток постоянно подвергается выраженным деформирующим воздействиям в кровеносном русле. [9]

Для нормального функционирования эритроцит должен в течение относительно длительного периода времени сохранять свою целостность и быть хорошо деформируемым; последнее свойство важно прежде всего для нормальной микроциркуляции. В свою очередь деформируемость определяется рядом факторов, основные из которых – форма клетки и эластичность мембраны. Сейчас можно считать доказанным, что эти свойства мембраны эритроцита и клетки в целом обусловлены наличием белковой мембранной структуры, именуемой мембранным скелетом клетки и расположенной на внутренней стороне мембраны. [9] Плазматическую мембрану эритроцитов следует рассматривать как открытую динамическую структуру, способную специфически и неспецифически связывать белки плазмы крови и цитозоля эритроцитов. [6] Исследователи пытаются выяснить механизмы метаболического регулирования белковых взаимодействий компонентов мембранного скелета между собой, а также с интегральными белками мембраны, что должно подвести к пониманию природы таких процессов, как изменение формы и деформируемости, работа транспортных систем, изменение ионной проницаемости мембраны. В данном обзоре сделана попытка обобщить и осмыслить имеющиеся данные по этому вопросу.

Современные представления о структуре и функции мембранного скелета эритроцитов человека и других млекопитающих сложились в основном за последние 25 – 30 лет. За этот период опубликован ряд подробных обзоров. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю поверхность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. Мембранный скелет виден в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготовления препарата для микроскопии. Белковые компоненты мембранного скелета были идентифицированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС).

Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембраны эритроцитов человека является работа Фейрбанкса и соавторов, в которой авторы предложили номенклатуру полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированных с помощью ДДС мембране; этой номенклатурой пользуются в настоящее время большинство исследователей. При одновременном электрофорезе солюбилизированных белков эритроцитарной мембраны в ПААГ в присутствии ДДС выявляется 20 полос, однако Фейрбанкс с соавторами выделили 7 основных полос, которые были пронумерованы от катода к аноду. В последующие годы были внесены лишь незначительные уточнения в эту номенклатуру. [9]

В связи со способом расположения макромолекул в мембране эритроцита белки делят на периферические (внутренние) и интегральные. Интегральные удерживаются в мембране. В их состав входят гликопротеины и протеолипиды. Функции интегральных белков разнообразны: они могут выступать в роли гидролитических ферментов, рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов и в качестве специфических белков входит в состав цитоскелета, который представляет собой двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной эритроцита через взаимодействие с интегральными белками. Также к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов.

Метод фракционирования мембранных белков одномерным электрофорезом в ПААГ в присутствии ДДС позволили разделить белки мембраны относительно их электрофоретической подвижности, и полученным фракциям белков были даны номера по мере уменьшения их молекулярной массы.

Полосы 1 и 2 Включают отдельные a- и b-субъединицы спектрина.

Спектрин – основной белок цитоскелета эритроцитов. Спектрин образует двумерную сеть, к которой крепятся актиновые олигомеры. Молекула спектрина представляет собой ab-гетеродимер. По данным электронной микроскопии, гетеродимеры имеют форму изогнутых фибрилл длиной около 100 нм. Они могут принимать разные конфигурации. Каждая цепь молекулы спектрина содержит более 2000 аминокислотных остатков и состоит из линейно расположенных структурных доменов. Доменная структура была установлена с помощью анализа пептидных фрагментов субъединиц. Вторичная структура a- и b-субъединиц сходна и представляет собой a-спиральные участки, разделенные чувствительными к протеолизу b-структурами. Димеры спектрина ассоциируются с b-цепью другого димера "голова к голове". Никогда не встречаются a-a- или b-b-связи. Между димерами и тетрамерами существуют обратимые переходы, которые зависят от условий среды. При 37 °С спектрин экстрагируется из мембран эритроцитов в форме димера, при 4 °С – в форме тетрамера. При 30 и 40 °С в растворе между димерами и тетрамерами устанавливается равновесие. Так как в обычных условиях получения спектрин экстрагируется в форме тетрамера, полагали, что in vivo спектрин находится в той же форме. Электронно-микроскопический анализ свидетельствует о том, что такие олигомеры образуются в результате ассоциации 3-7 димеров спектрина. Полагают, что в эритроцитах присутствуют как олигомеры, так и тетрамеры, которые образуют двумерную сеть цитоскелета. Молекула спектрина подвергается множественному фосфорилированию, степень которого не влияет на форму эритроцитов. [5]

Полосы 2.1, 2.2, 2.3 Представлены различными формами периферического белка анкирина. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что сеть спектрина расположена на определенном расстоянии от мембраны и, по-видимому, взаимодействует интегральными белками мембраны. Латеральная подвижность интегральных белков зависит от присутствия спектрина: это подтверждает наличие такого взаимодействия. При обработке мембран химотрипсином был выделен белковый фрагмент с мол. массой 72 kD, который ингибировал взаимодействие спектрина с эритроцитарной мембраной, обедненной спектрином. Белок был назван анкирином, от греческого ankyra, что значит заякоривать. Другая группа исследователей назвала его синдеином, от греческого syndeo, что значит связываться вместе. Молекула анкирина (мол. масса 200 kD) имеет сферическую форму и состоит из двух доменов: нейтрального и фосфорилированного. Фосфорилированным доменом анкирин взаимодействует с b-субъединицей спектрина на расстоянии 20 нм от С-конца молекулы. Нейтральный домен анкирина осуществляет связь с белком полосы 3. [5,6]

Белок полосы 3 Белок 3 (анионтранспортный белок) – один из основных интегральных белков эритроцитарной мембраны – является гликопротеидом с мол. массой 90 kD. Показано, что этот белок принимает участие в обеспечении анионного транспорта, в связывании цитоскелетного каркаса с мембраной, цитоплазматических белков гемоглобина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Не все молекулы белка 3 взаимодействуют с анкирином. Если бы все молекулы белка 3 были связаны с анкирином и, следовательно, со всей спектриновой сетью, это исключило бы возможность латеральных перемещений самого белка, образования кластеров и транспортных функций. Связь спектрина с мембраной осуществляется, вероятно, не только через анкирин, но также с помощью дополнительных взаимодействий. Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что белок 4.1 обеспечивает связь спектрина с интегральным белком мембраны. [5] Все перечисленные дополнительные взаимодействия носят слабый характер и, видимо, играют второстепенную роль по сравнению со взаимодействием спектрин―анкирин―белок 3.

Белок полосы 4.1 Необходим для нормальной стабилизации мембраны, закрепляет связь спектрина с актином. На электрофореграмме данный белок разделяется на две полосы: 4.1а (Mr=80 kD) и 4.1b (Mr=78 kD). Переход 4.1а в 4.1b осуществляется с помощью деамидирования. Это глобулярный белок с мол. массой 80 kD, составляющий около 5% от белковой массы цитоскелета эритроцитов. Его изоформы сходны по аминокислотному составу. Обе изоформы способны взаимодействовать со спектрином. Каждая из них содержится в количестве примерно 100 000 молекул на 1 клетку. [5]

Белок полосы 4.2 Паллидин – это олигомер (Mr=72 kD), в клетке присутствует в димерной и тримерной формах с Mr=185 kD. Соединяется с цитоплазматическим доменом белка полосы 3, анкирином, спектрином и белком полосы 4.1. [14]

Белок полосы 4.5 В его состав входят интегральные белки – переносчики нуклеозидов и глюкозы через эритроцитарную мембрану. Основная часть белков полосы 4.5 представлена транспортерами глюкозы (Mr=55 kD). [14]

Белок полосы 4.9 Центральный компонент цитоскелета с Mr=48 kD. Этот белок выделен в виде тримера с Mr=145 kD. Стабилизирует взаимодействия спектрина с актином и влияет на степень его полимеризации. Это фосфопротеин. Белок присутствует в эритроцитах в количествах, приблизительно равных количеству спектрина. О функциях этого белка практически ничего не известно. Возможно, он принимает участие в укреплении цитоскелетного каркаса (сети цитоскелета). Показано, что очищенный полипептид полосы 4.9 может взаимодействовать с актиновыми нитями, снижая скорость полимеризации актина и, возможно, стабилизируя короткие актиновые нити в эритроцитах. [5]

Полоса 5 Актин – представлен в эритроцитах b-изоформой и по физико-химическим свойствам схож с актином поперечнополосатых мышц. Так как функциональной формой актина является его полимер, изначально пытались выяснить, есть ли в эритроцитах филаментный актин. Электронно-микроскопические исследования показали, что актин присутствует в эритроцитах в виде филаментов, содержащих от 12 до 17 мономеров актина. [5] Выделенные мембраны эритроцитов, а также комплекс спектрина, актина и белка 4.1 способны индуцировать полимеризацию мономерного актина, подобно олигомерам актина. Обработка цитохалазином В подавляет полимеризацию. Так как типичный фибриллярный актин не выявляется в нативных эритроцитах, а в опытах in virto можно индуцировать образование длинных филаментов, связанных с мембраной, следует, по-видимому, предположить, что в эритроцитах существуют какие-то механизмы, ограничивающие рост филаментов, подобно тому, как это делает цитохалазин В. Актиновые олигомеры связываются с N-концом молекулы спектрина латерально. Каждый тетрамер спектрина имеет два сайта связывания для актиновых олигомеров. Спектрин может связываться с Ф-актином по всей длине актиновой нити, и эти связи, видимо, существенны для образования цитоскелетной сети. Важная роль во взаимодействии актина и спектрина принадлежит белку полосы 4.1, который связывается со спектрином в тех же участках, что и актин. Связь спектрина с актином в отсутствие белка 4.1 слабая и значительно усиливается в его присутствии, поэтому взаимодействие спектрина и актина называют 4.1-зависимым. Комплексы белка 4.1, спектрина и актина обладают гораздо большей устойчивостью к диссоциации при седиментации в сахарозе, чем комплексы актина и спектрина.

Возникает вопрос о том, какие факторы оказывают влияние на полимеризацию эритроцитарного актина. Относительно низкая концентрация актина в эритроцитах не может, вероятно, иметь решающего влияния на длину филаментов. Предположим, что на полимеризацию актина могут влиять такие актинсвязывающие белки, как спектрин и белок 4.1. Оказалось, что эти белки способны регулировать скорость полимеризации актина, сокращая лаг-фазу, уменьшая скорость элонгации и не вызывая при этом никаких изменений в последовательности этапов полимеризации. Спектрин и белок 4.1 вызывают нуклеацию глобулярного актина в условиях, когда концентрация актина ниже критической и спонтанная полимеризация не происходит. Таким образом, можно предположить, что спектрин и белок 4.1 представляют собой комплекс белков, блокирующих медленный конец актиновой нити в отличие от большинства "запирающих" белков, взаимодействующих с быстрым концом. Однако позже были получены данные, которые противоречат этому предположению. Шен с соавторами выделили фрагменты цитоскелета эритроцитов при обработке растворами с низкой ионной силой при 37 °С. [5] Электронно-микроскопические исследования полученных фрагментов показали, что часть из них содержит филаменты актина, вдоль которых кластерами располагаются спектриновые молекулы. При инкубации этих препаратов с глобулярным актином (при концентрации актина в растворе выше критической) происходил рост актиновых нитей на обоих концах. Тсукита с соавторами изучали полимеризацию актина на мембранах эритроцитов, закрепленных на электронно-микроскопических сектах. При инкубации этих препаратов с глобулярным актином на внутренней поверхности мембран, содержащих цитоскелетные белки наблюдался рост актиновых филаментов. [5] При концентрациях глобулярного актина, близких к критическим, рост наблюдался только на медленном конце, а при дальнейшем увеличении концентрации – на обоих концах нити. При обработке мембран "кэпирующим" белком с мол. массой 45 kD, связывающимся с быстрым концом актиновых микрофиламентов, рост наблюдался только на медленном конце. Данные Шена и Тсукиты приводят к выводу о том, что в эритроцитах актин существует в виде филаментов со свободными концами. Следовательно, спектрин и белок 4.1 не являются кэпирующими белками, однако несомненно влияют на состояние актина в эритроцитах, стабилизируя актиновые филаменты.

Белок полосы 6 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), молекулярная масса составляет 35 kD. Располагается на цитоплазматическом домене анионтранспортного белка, в составе мультиферментного комплекса. Данный белок является ферментом гликолиза и принимает участие в регуляции окисления гемоглобина. [14]

Полоса 7 Основной составляющей полипептид – тропомиозин. Долгое время оставалась неизвестной природа белка зоны 7. Было показано, что этот белок связывается с антителами к тропомиозину, выделенному из мускульного желудка цыпленка. Молекулярная масса белка совпадала с молекулярной массой тропомиозинов, выделенных из мозговых тканей, из макрофагов и кровяных пластинок. Тропомиозин эритроцитов – димер с мол. массой 60 kD, состоящий из двух субъединиц с мол. массой 29 и 27 kD и связывающийся с мышечным актином (Ф-актином) при соотношении: 1 молекула тропомиозина на 6-7 мономеров актина. Так как в эритроцитах филаменты актина содержат до 15-17 мономеров, они могут связывать две молекулы тропомиозина. [5]

Полоса 8 Представлена пептидной частью фермента глутатион-S-трансферазы (Mr=23 kD). Взаимосвязь белка полосы 8 с мембраной является кальций – зависимой.

В 1985 г. было показано, что еще одним компонентом цитоскелета эритроцитов является миозин. С помощью моноклональных антител к тяжелой цепи миозина Фаулер обнаружил в эритроцитах полипептид, который был выделен и охарактеризован. Белок состоит из тяжелой цепи с мол. массой 200 kD и из двух легких цепей с мол. массами 26 и 19,5 kD. В растворах с низкой ионной силой он образует биполярные филаменты и обладает АТФазной активностью. В эритроцитах миозин присутствует примерно в количестве 6000 молекул на 1 клетку, т.е. на 1 молекулу миозина, как и в других клетках, приходится около 80 мономеров актина. [5]

Белки, образующие цитоскелет эритроцитов, неуникальны. Они или им подобные белки есть во многих других клетках. Преимущественная их локализация – вблизи мембран. Вероятно также, что рассмотренные белки могут быть полифункциональны и использоваться в структурных комплексах разного функционального назначения. [5]

Полосу 9 на электрофореграмме составляет белок глобин, который является частью мембрансвязанного гемоглобина. Как уже говорилось выше, цитоплазматический домен белка полосы 3, включающий около 380 аминокислотных остатков, локализован в цитоплазме и играет важную роль в поддержании формы эритроцита и его метаболизме. N-концевая последовательность цитоплазматического домена богата аминокислотными остатками кислого характера. На этом участке находятся центры связывания гидролитических ферментов – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, альдолазы, каталазы, гемоглобина и гемихрома. Таким образом, цитоплазматический домен анионтранспортного белка и является местом локализации мембрансвязанного гемоглобина, о структуре, свойствах и некоторых аспектах функционирования которого будет сказано ниже.

Гемоглобин Гемоглобин – белок эритроцитов, красных кровяных клеток, переносящий молекулярный кислород от легких к тканям в организмах позвоночных животных. Гемоглобин можно считать своего рода модельным белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Американский физик Хопфилд назвал его атомом водорода современной биохимии, имея в виду, что изучение гемоглобина сыграло в биохимии ту же роль, что и изучение атома водорода в физике. Гемоглобин называют также почетным ферментом, поскольку исследования его структуры в статике и динамике позволили значительно продвинуться в понимании механизмов функционирования ферментов. Структура этого глобулярного белка известна в деталях главным образом благодаря работам английского биофизика Макса Перутца, который получил первые рентгеноструктурные данные еще в конце 40-х годов нашего века. За эти исследования он был удостоен Нобелевской премии.

Структура гемоглобина Молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц: двух a и двух b - и соответственно содержит четыре полипептидные цепочки двух сортов. Каждая a-цепочка содержит 141, а b-цепочка – 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула гемоглобина включает 574 аминокислоты. Хотя аминокислотные последовательности a- и b-цепочек различны, они имеют практически одинаковые третичные пространственные структуры. Собственно говоря, приведенные выше детали структуры относятся не к гемоглобину, а к его белковой компоненте – глобину. Каждая субъединица гемоглобина содержит одну небелковую (так назваемую простетическую) группу – гем. Гем представляет собой комплекс Fe(II) с протопорфирином. Структура гема представлена на рис.1, а. [2]

Атом железа может образовать шесть координационных связей. Четыре связи направлены к атомам азота пиррольных колец, оставшиеся две связи –

Рис.1. Структура гема (а), структура активного центра дезоксигемоглобина (б), структура активного центра оксигемоглобина (в).

перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца по обе его стороны. Гемы расположены вблизи поверхности белковой глобулы в специальных карманах, образованных складками полипептидных цепочек глобина. Гемоглобин при нормальном функционировании может находиться в одной из трех форм: феррогемоглобин (обычно называемый дезоксигемоглобином или просто гемоглобином), оксигемоглобин и ферригемоглобин (называемый также метгемоглобином). В феррогемоглобине железо находится в закисной форме Fe(II), одна из двух связей, перпендикулярных к плоскости порфиринового кольца, направлена к атому азота гистидинового остатка, а вторая связь свободна (рис.1, б). Кроме этого гистидинового остатка, называемого проксимальным (соседним), по другую сторону порфиринового кольца и на большем расстоянии от него находится другой гистидиновый остаток — дистальный гистидин, не связанный непосредственно с атомом железа. Взаимодействие молекулярного кислорода со свободным гемом приводит к необратимому окислению атома железа гема [Fe(II) Þ Fе(III); гем Þ гемин]. В дезоксигемоглобине глобин предохраняет железо гема от окисления.

Реакция оксигенации Обратимое присоединение кислорода (оксигенация), позволяющее гемоглобину выполнять свою основную функцию переносчика, обеспечивается возможностью образовать прочные пятую и шестую координационные связи и перенести электрон на кислород не от железа (то есть окислить Fe²⁺), а от имидазольного кольца проксимального гистидина. Это схематически изображено на рис.1, б. Вместо молекулярного кислорода железо гема может присоединить окись углерода СО (угарный газ). Даже небольшие концентрации СО приводят к нарушению кислородпереносящей функции гемоглобина и отравлению угарным газом.

Выше было сказано, что одна молекула гемоглобина содержит четыре субъединицы и, следовательно четыре гема, каждый из которых может обратимо присоединить одну молекулу кислорода. Поэтому реакцию оксигенации можно разделить на четыре стадии:

Hb+O₂ Û HbO₂ (1a)

НbO₂+O₂ Û Hb(O₂)₂ (1б)

Hb(O₂)₂+O₂ Û Hb(O₂)₃ (1в)

Hb(O₂)₃+O₂ Û Hb(O₂)₄ (1г)

Прежде чем рассмотреть эту главную функциональную реакцию гемоглобина более детально, необходимо сказать несколько слов о мышечном гемоглобине — миоглобине. Этот красящий белок поперечнополосатых мышц представляет собой комплекс гема с "четвертушкой" глобина. Он содержит одну молекулу гема и одну полипептидную цепочку, состав и структура которой подобны составу и структуре b-субъединицы гемоглобина. Как и для гемоглобина, важнейшей функцией миоглобина является обратимое присоединение молекулярного кислорода. Эту функцию характеризует так называемая кривая оксигенации, связывающая степень насыщения гемоглобина кислородом (в процентах) с парциальным давлением последнего, рО₂ (мм Hg). Типичные кривые оксигенации гемоглобина и миоглобина (при условии достижения химического равновесия) приведены на рис.2, а, б. Для миоглобина кривая является гиперболой, как и должно быть в случае одностадийной химической реакции при условии достижения химического равновесия:

Mb+O₂ÛMbO₂ (2)

где Mb - миоглобин.

Рис. 2 Кривые оксигенации

миоглобина (а) и гемоглобина (б)

Совершенно другая картина возникает в случае гемоглобина. Кривая диссоциации имеет S-образную форму. Без кислорода молекулы гемоглобина обладают низким сродством к кислороду и равновесие реакции (1а) сдвинуто влево. Затем кривая становится круче и при высоких значениях рО₂ практически сливается с кривой диссоциации миоглобина. [2]

 

Рис. 3. Логарифмические анаморфозы кривых оксигенации миоглобина (a) и гемоглобина (б)

М.Перутц пишет, что распределение молекул кислорода по молекулам гемоглобина следует библейской притче: "Каждому, у кого есть, дай еще, и унего будет избыток; у того же, у кого нет, забери то немногое, что у него осталось". Это заставляет предположить, что между гемами одной молекулы гемоглобина существует некоторая связь, благодаря которой присоединение кислорода к одному гему влияет на присоединение кислорода к другому гему той же молекулы. Это явление было известно задолго до работ Перутца и установления структуры гемоглобина и механизма его реакции с кислородом. Оно получило название гем-гем взаимодействия. Физиологический смысл гем-гем взаимодействия очевиден. Сигмоидная форма кривой диссоциации создает условия максимальной отдачи кислорода при переносе гемоглобина от легких с высоким значением pO₂ к тканям с низким значением pO₂. Для человека значения pO₂ артериальной и венозной крови в нормальных условиях (Т 37°С, pH 7,4) равны соответственно 100 и 40 ммHg. При этом (рис.2, б) гемоглобин отдает тканям 23% связанного кислорода (степень оксигенации меняется от 98 до 75%). При отсутствии гем-гем взаимодействия для одногемового миоглобина (рис.2, а) эта величина не превышает 5%. Миоглобин поэтому служит не переносчиком, а депо кислорода и отдает его мышечной ткани лишь при резкой гипоксии, когда насыщение ткани кислородом падает до недопустимо низкого значения. [2]

Логарифмическая анаморфоза кривой диссоциации гемоглобина человека представлена на рис.3, б. В этом случае начало кривой представляет собой прямую под углом 45° к координатным осям, как и для миоглобина: первые молекулы кислорода соединяются в основном с молекулами гемоглобина, еще не содержащими кислорода, и гемы таким образом оксигенируются независимо. Это свидетельствуют о том, что гем-гем взаимодействие обусловлено не просто наличием нескольких гемов в молекуле, а тем, что после оксигенации одного гема меняются условия оксигенации других гемов той же молекулы. Затем наклон кривой увеличивается. Тангенс угла максимального наклона получил название коэффициента Хилла (n), который отражает степень кооперативности процесса. Для миоглобина n=1, а для гемоглобина человека (в норме) n~3. Вблизи области полного насыщения гемоглобина кислородом наклон кривой снова становится равным 45° (большинство молекул гемоглобина либо не содержат свободных гемов, либо имеют лишь один гем, способный присоединить кислород).

Механизм кооперативности В 1963 году Моно, Шанже и Джекоб обнаружили, что активность некоторых ферментов меняется скачком между двумя значениями при воздействии на белок некоторых низкомолекулярных агентов, не принимающих участия непосредственно в каталитическом акте. Такие ферменты получили название аллостерических, а само явление – аллостерии. Предполагается, что эти ферменты могут находиться в разных состояниях, переключение между которыми осуществляется при присоединении специфического низкомолекулярного лиганда (необязательно вблизи активного центра). В 1965 году Моно, Уайман и Шанже поняли, что гемоглобин, не являясь ферментом, принадлежит к тому же классу белков. К тому времени уже было известно, что структуры глобул оксигемоглобина и гемоглобина различны, и авторы предположили, что состояния с разными значениями констант оксигенации соответствуют различным пространственным структурам белка. Для гемоглобина постулируется наличие двух таких состояний: R (от англ. relaxed) и Т (от англ. tense). Состояние R характеризуется высоким, а Т – низким сродством к О₂ (сильнее и слабее связывают молекулярный кислород соответственно). В рамках этой концепции считается, что как в R-, так и в Т-состоянии сродство к кислороду субъединиц одной глобулы (т.е. есть всех четырех гемов одной глобулы) одинаково. Этот постулат позволяет построить сравнительно простую математическую модель кооперативных свойств гемоглобина: К_R, К_Т и L (константы равновесия реакций ассоциации в состояниях R, Т и отношение числа молекул гемоглобина в состояниях Т и R соответственно). На рис.2, б ясно, что К_Т<К_R. Очевидно, увеличение константы ассоциации при переходе из состояния Т в состояние R соответствует в расчете на один гем изменению свободной энергии системы

DG = 2,3 RT lg(K_R/K_T) кДж/моль. (7)

Для гемоглобина человека при 37°С эта "свободная энергия кооперативности" равна 5,61 кДж/моль. В физиологических условиях при отсутствии кислорода лишь ~ 3·10^-5 % молекул гемоглобина находятся в R-форме, а в условиях полного насыщения кислородом лишь ~ 7-10^-3 % — в Т-форме. [2]

Изменения электронной и пространственной структуры гемоглобина в процессе оксигенации На рис.4 схематически показаны электронная структура железа гема, положение атома железа относительно плоскости порфиринового кольца гема, спектральные и магнитные характеристики молекул в различных состояниях молекулы гемоглобина: дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и ферригемоглобин. Следует подчеркнуть, что во всех случаях речь идет о равновесных состояниях молекул белка. Мы увидим далее, что переход из одного состояния в другое требует значительного (в молекулярных масштабах) времени, в течение которого система проходит через несколько неравновесных состояний, заметно отличающихся по своим физическим и химическим свойствам от равновесных. [2]

В молекуле дезоксигемоглобина железо отстоит от плоскости порфиринового кольца примерно на 0,5-0,6 А° (есть небольшие отличия между a- и b-субъединицами). Из шести 3d электронов железа Fe(II) два электрона спарены на одной из низших d-орбиталей (d_xy, d_yz, d_xs), а четыре электрона занимают оставшиеся d-орбитали, их спиновые моменты, согласно правилу Хунда, параллельны и суммарный спин S-2. Магнитный момент гема в этом состоянии равен ~ 5,5 боровского магнетона (БМ), а спектр поглощения в зеленой области имеет характерную полосу с l_max ~ 556 нм. Присоединение кислорода ведет к значительным изменениям. Атом железа в оксигемоглобине лежит практически в плоскости порфиринового кольца (расстояние до плоскости составляет 0,16 А° в α- и 0,00 А° в β- субъединицах). Все шесть d-электронов спарены на трех низших d-орбиталях, S= 0, оксигемоглобин диамагнитен. В зеленой области спектра имеются две характерные полосы поглощения: а (l_max