Секвенирование (Генная инженерия)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение …………………………………………………………………………………………3

1. Определение нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта ……………………………………………………………………………………….4

2. Секвенирование ДНК методом полимеразного копирования ( метод Сэнгера) …………8

3. Филогенетический анализ геномов вирусов ………………………………………………15

4. Компьютерный анализ генетических текстов ……………………………………………..18

Заключение ……………………………………………………………………………………..22

Список литературы …………………………………………………………………………….23

ВВЕДЕНИЕ.

Разработка методов клонирования и определения последовательнос­ти оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии. Эти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на моле­кулярном уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями.

Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время стало ру­тинным методом молекулярной биологии. Несомненно, в ближайшем бу­дущем появятся еще более совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкому увеличению числа расшифрованных последова­тельностей.

Благодаря знанию генетического кода появилась возможность опре­делять участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потен­циальные белки. Этот источник и сегодня дает нам ос­новную информацию о функциональном строении нуклеотидной последо­вательности.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ МАКСАМА И ГИЛБЕРТА.

Быстрый прогресс, наблюдавшийся в последние годы в различных областях молекулярной биологии, во многом обусловлен появлением эффективного ме­тода определения первичной структуры ДНК. Этот метод, предложенный в 1977 г. Максамом и Гилбер­том, основан на селективной химической модифика­ции различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким обра­зом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем моди­фицировалось только одно звено данного типа. По­скольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифициро­ванным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению моди­фицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах от­щепления гетероциклов (рис. 1).

Модификации подвергают ДНК, ³²Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью -³²Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химичес­кой деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответст­вуют положению мономерных звеньев того типа, ко­торый подвергался модификации. Концевая радиоак­тивная метка служит точкой отсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2)

Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разде­лять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с ра­диоавтографа геля.

Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16 звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае ре­акции химической модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции) с целью повышения степени модификации.

Рисунок 1.1 Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным амином или щелочью.

Рисунок 2 Химическая деградация ДНК.

Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина – обработка диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и гуанина – апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина – расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином (рис. 4).

В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химической модификации ДНК проводят в растворе, а во вто­ром ДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (напри­мер, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для сек­венирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преи­муществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудова­ния. В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемле­мых результатов, а выбор одного из них определяется конкретными условиями лаборатории.

Рисунок 3 Реакция селективного расщепления по остаткам гуанина

Рисунок 4 Реакция селективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.