О передаче метаболических сигналов в системе  нейрон – нейроглия

2. О передаче метаболических сигналов в системе  нейрон – нейроглия.

(Н. Г. Алексидзе Тбилисский гос. Университет, Тбилиси, СССР)

Гипотеза А. И. Ройтбака об участии глиальных клеток в за­мыкании временных межнейрональных контактов стимулировала ис­следования по биохимии нейронно – нейроглиальных взаимоотношений В настоящее время всеми признается что нейрон-нейроглия является функциональной единой системой, однако материальная сущность пе­редатчиков сигнала от нейрона на клетки глии и многие вопросы, связанные с его реализацией в метаболические процессы, оста­ются открытыми.

Было высказано предположение, что биохимический цикл глиального обеспечения функции нейронов осуществляется путем обрат­ной метаболической связи при непосредственном участии в качестве передатчиков сигнала нейромедиаторов, К+, аммиака и др. соедине­ний. Предпосылки для такого заключения имелись как в нейрохи­мической, так и в физиологической литературе, но требовалось коррелятивное сопоставление физико-химического состоя­ мембран глии с биохимическими процессами в них в условиях мо­делирования возбуждающего и тормозного состояния нейрон – нейроглиального комплекса.

Исходя из вышесказанного мы предприняли исследование участия К⁺, нейромедиаторов и аммиака в передаче метаболических сигналов от нейрона на клетки нейроглии в условиях их целостного состояния, на уровне изолированных единичных нейронов и глиального скопле­ния или же обогащенных нейронами и глиальными клетками фракций.

МЕТОДИКА.

Объектом исследования служили беспородные белые крысы и кролики. Нейроны и глиальные клетки выделяли из срезов головного мозга кроликов методом Хидена, обогащенные нейронами и глиальными клетками фракции — из коры больших полушарий крыс и кроликов по прописи Роуза в модификации. Скорость погло­щения кислорода изолированными нейронами в глиальными клетками измеряли методом поплавка в модификации Хидена и Пигона, в опытах с обогащенными фракциями был использован полярографический метод определения дыхания.

Результаты.

Влияние К+ на скорость потребления клетками глии и нейронов.

Впервые, об особой чувствительности глиальных клеток к К+ указал Куффлер с сотрудниками. Позже этот вывод был обоснован биохимически датским ученым Хертцом. Однако анализ его результатов был затруднен, так как изолированные нейроны были получены в основном из коры головного мозга кошек, а скопления глии - из коры мозга крыс.

Кроме того, имелись определенные недостатки и в методике исследования. После разработки метода дубль поплавка удалось показать стимулирующее влияние К+ на дыхание клеток глии вестибулярного ядра Дейтерса, а нейроны, даже в специальных опытах с предварительно измененным содержанием К+ в инкубационной среде от 5мМ до 60мМ, не обнаруживали существенных различий в скорости поглощения кислорода.

Рисунок 1. Влияние К+ на дыхание нейрона(2) и нейроглии(3) латерального вестибулярного ядра Дейтерса кролика. Стрелками указан момент добавления К+ в инкубационную среду. 1-контроль, без нервных клеток.

В опытах с обогащенными нейронами и глиальными клетками фракциями при избытке К+ Бредфорд и Роуз наблюдали примерно равное усиление их дыхания, а согласно данным Хультборна и Хидена скорость поглощения кислорода изолированными нейрональными клетками возрастала примерно в 2 раза. Вотличии от результатов Бретфорда и Роуза, работая с фракциями обогащенными нейронами и глиальными клетками, Халиаме и Хамбергер подтвердили результаты Хертца и наши об особой чувствительности клеток глии к К+. В связи с такими разногласиями о дей­ствии К⁺ на нервные клетки, мы провели анализ экспериментальных условий описанных выше опытов. Как выяснилось, при получении обо­гащенных нейронами и глиальными клетками фракций в градиенте фикола и сахарозы в среде Роуза концентрация, К+ была 100 мМ, а в среде Хамбергера, Хертца и нашей, концентрация К⁺ не превышала 5 мМ. Из данных литературы известно, что повышение концентрации К⁺ до 100 мМ и выше вызывает моментальное и обычно необратимое изменение цитоплазмы глиальных клеток и ее сморщивание. Высокие концентрации К⁺ в среде культивирования нервных клеток вызывали увеличение объема глиальных клеток и уменьшение содержания в них сухого остатка. В нейронах та­кие изменения не были найдены. Следовательно, можно было пред­положить, что низкая чувствительность глиальных клеток к К⁺ в опытах Брэдфорда и Роуза в условиях повышенного содержа­ния К⁺ в среде их выделения обусловлена предварительной деполя­ризацией и сенсибилизацией мембран глии. Это было доказано экс­периментально.

При замене К⁺ ионами натрия в среде выделения нервных клеток резко возрастает чувствительность обогащенных глиальными клетками фракций к К+ усиление дыхания, по отноше­нию к контролю (1,5 мМ К+), составило примерно 90%. Таким образом, была выяснена причина разногласия относительно чувствительности нервных клеток к К+ и высказано предположение об участии К⁺ в передаче метаболического сигнала от нейрона на клетки нейроглии.

Ацетилхолин как передатчик метаболического сигнала в системе нейрон-нейроглия.

При изучении возможной роли ацетилхолина (АХ) в качестве пе­редатчика метаболического сигнала в нейрон-нейроглиальной системе мы исходили из следующих фактов 1) ацетилхолин освобождается при возбуждении и вызывает сдвиги в мембранной активности глии;

Таблица 1

Влияние ацитилхолина(АХ) на скорость поглощения кислорода (О_АХ) обогащенными клетками глии фракций при разных соотношениях К+/АХ. О₀-скорость поглощения кислорода без АХ. Концетрация АХ-10^-5г/мл

К+ мМ	Скорость поглощения кислорода мкА О2/мин
	Оо	%	Оах	%	В % к Оо
5 мМ	6,82±0,45	100	8,06±0,81	100	118,2
40 мМ	10,21±0,62	161,1	12,87±0,42	159,7	126,1
60 мМ	13,45±0,73	197,2	12,5±0,54	155,1	92,2

2) под влиянием АХ изменяется активность ряда ферментов обмена углеводов, липидов, белков, нуклеиновых кислот и т.п.

В связи с вышеизложенным, мы предприняли исследование на­личия связи между изменением мембранной активности клеток глин и углеводным обменом в них при воздействии АХ. При этом особое внимание обращалось на соотношение К+ к АХ (К⁺—5 мМ/АХ — 10^-5 г/мл; К⁺- 40 мМ/АХ—10^-5 г/мл; К⁺—60 мМ/АХ—10^-5 г/мл).

Было установлено (табл. I), что при концентрации К⁺ 5 мМ ско­рость поглощения кислорода клетками глии в присутствии АХ воз­растает на 18%. При более высокой концентрации К⁺ (40 мМ) эф­фект АХ усиливается и достигает 26%, а при концентрации К⁺ 60 мМ стимулирующий эффект АХ на дыхание элиминируется, а по сравне­нию с контролем даже проявляется тенденция к торможению. Сти­мулирующий эффект АХ на скорость поглощения кислорода полно­стью исчезает в присутствии аптихолинэргического агента — атропина. Этот факт указывал на существование холинэргического рецепто­ра на мембранах глии, что в настоящее время является хорошо дока­занным экспериментально. Подтверждается существование холинэргического механизма регуляции дыхания глиальных клеток, где роль информатора сигнала может выполнить возбуждающий нейропередатчик АХ.

ГАМК как передатчик метаболического сигнала в нейрон-нейроглиальной системе.

Из данных литературы известно, что под влиянием ГАМК изме­няется мембранная активность глии и стимулируются окисли­тельные процессы в нервной ткани. Следовательно, можно было допустить, чти и ГАМК может претендовать на роль метаболическо­го сигнала. С целью решения данного вопроса в качестве объекта были взяты нервные клетки ядра Дейтерса кролика, где функцию нейропередатчика выполняет ГАМК. Изменения в содержании ГАМК вызывали введением ГАМК и фармакологических веществ (гидроксиламин, тиосемикарбазид), действие которых связано с обме­ном ГАМК. Об изменении метаболической активности изолированных ней­ронов и клеток глии судили по сукцинатоксидазной (СО) активности (СОА), которая является удобным тестом для оценки функционально­го состояния нервных клеток.

Было установлено, что в зависимости от уровня содержания ГАМК в головном мозгу активность СО меняется реципрокно: ГАМК подавляет активность фермента в нейронах, а в глии напротив—­стимулирует. Под влиянием гидроксиламина по сравнению с нормой более чем в 2 раза возрастает САО нейронов, в нейроглии—подав­ляется. Тиосемикарбазид также стимулировал СОД в нейронах, но не оказывал влияния на активность фермента в клетках глии. Учи­тывая разнонаправленность действия ГАМК, гидроксиламина и тиосемикарбазида па количественное распределение ГАМК в головном мозгу и результаты влияния ГАМК на окислительное фосфолирование было сделано заключение, что в регуляторных механиз­мах окислительных процессов нервных клеток значение имеет не об­щее содержание ГАМК в мозгу, а ее распределение во внутри- и в внеклеточном пространстве. Следовательно, и ГАМК может выпол­нить функцию передатчика сигнала в нейрон-нейроглиальной системе.

Аммиак как передатчик метаболического сигнала в нейрон-нейроглиальной системе.

Уровень аммиака в головном мозгу является одним из показате­лей функционального состояния ЦНС. Как было установлено, обмен аммиака находит свое отражение в мембранной активности клеток глии, что послужило основанием изучения его возможной роли в передаче информации о функциональном состоянии нейронов на перинейрональные клетки. С целью биохимического обоснования такого механизма мы исследовали дыхание обогащенных клетками глии фракций в опытах in vitro в зависимости от концентрации аммиака в среде инкубации. В качестве субстрата дыхания использовали глутамат и глутамин. Дыхание клеток глии в присутствии глутамата слу­жило контролем. В опытных вариантах образование глутамата, суб­страта дыхания, происходило в результате распада глутамина. Следо­вательно, при такой постановке опытов, критическими были: величи­на активности глутаминазы глии и скорость освобождения аммиака глутамата.

Рис. 2 Скорость поглащения кислорода глиальными клетками в присутствии глутаминовой кислоты (1) и глутамина (2).

Предварительные опыты по изучению глутаминазной активности глии показали, что она является аллостерическим ферментом вы­сокой степенью кооперативности, следовательно требовалось графиче­ское сопоставление скорости образования аммиака в инкубационной среде и скорости поглощения кислорода глиальными клетками. Как видно из рисунка 2, спустя одну минуту после добавления глутамина в инкубационную среду, в период максимального усиления дыхания, количество аммиака составляет 0,64 мкМ, через 4 мин, когда про­является тенденция угнетения дыхания— 1.40 мкМ а на 9-й мин, при торможении дыхания на 60%—3,20 мкМ. В опытах с глутаматом (контроль) нам не удалось обнаружить достоверных изменений в про­дукции аммиака и, следовательно, дыхание глиальных клеток во вре­мени возрастало линейно.

Суммируя вышеизложенное, мы считаем, что аналогично К⁺  АХ и ГАМК, аммиак также может участвовать в передаче метаболиче­ского сигнала от нейрона на нейроглиальные клетки.

Механизм инактивации нейропередатчиков глиальными клетками.

Исходя из того факта, что нейропередатчики могут выступать в роли переносчиков метаболических сигналов в нейрон-нейроглиальной системе, возникает вопрос о необходимости их инактивации глиальны­ми клетками. В настоящее время установлено, что глиальные клетки обладают способностью инактивировать нейропередатчики на уровне плазматической мембраны и внутриклеточно. Примером первого пути является гидролиз АХ глией без предварительного его захвата. Клетки глии характеризуются высокой ацетил- и бутирилхолинэстеразной ак­тивностью и легко могут устранить излишки АХ. Продукт гидро­лиза АХ холин, который обладает слабым холинэргическим эффек­том, устраняется клетками глии механизмом захвата высокого срод­ства. На примере ГАМК было показано, что в клетках глии имеется две системы его захвата: с высоким (К_м = -31 ± 7 мкМ) и низким (К_м--123±10 мкМ) сродством. Выявлены также механизмы ак­тивного захвата дофамина (К_м -0,07± 0,001 мкМ) и серотонина (К_м —0,083±0,002 мкМ). Дальнейшая судьба инактивации серо­тонина в клетках глии заслуживает особого внимания в связи с его отрицательным влиянием на синтез белков. Нам удалось уста­новить, один из возможных механизмов инактивации серотонина в клетках глии путем синтеза глюкуронида серотонина, последний в отличие от серотонина отличается более чем в 1000 раз меньшей биологической активностью.

Таким образом, выясняется, что относительно всех кандидатов, Претендующих на информативную роль в передаче метаболических сигналов, в клетках глин имеются мощные механизмы устранения их хеморецептивного воздействия на мембрану.