5.4. Выделение рибонуклеиновых кислот

Методы, используемые для экстракции рибонуклеиновых кислот, частично зависят от природы органа или организма. В одном из ранних методов, использованном Левиным, к густому тесту из дрожжей добавляли щелочь, смесь перемешивали с пикриновой кислотой, фильтровали и нуклеиновую кислоту осаждали из фильтрата добавлением соляной кислоты. Такая довольно жесткая обработка приводила к тому, что полученная нуклеиновая кислота значительно отличалась от «нативной» рибонуклеиновой кислоты. Для выделения рибонуклеиновых кислот, приближающихся по структуре к нуклеиновым кислотам живой клетки, необходимо избегать применения жестких условий (рН, температура) в то же время необходимо, насколько возможно, затормозить ферментативный распад. Широко применялась экстракция рибонуклеопротеидов изотоническим раствором хлористого натрия. Белки от нуклеиновых кислот могут быть отщеплены различными методами, такими, как обработка смесями хлороформа с октиловым спиртом, додецилсульфатом натрия, нитратом стронция или спиртом, а также расщепление белковой фракции трипсином. И снова эффективность каждого метода определяется природой рибонуклеопротеида. Для инактивации ферментов в процессе экстракции полезно применение хлоргидрата гуанидина (денатурирующего агента); для выделения рибонуклеиновых кислот и нативных рибонуклеопротеидов из дрожжей был применен метод, использующий адсорбцию рибонуклеаз на бентоните после предварительной обработки ионами цинка.

Особые преимущества имеет выделение рибонуклеиновых кислот из гомогенатов тканей млекопитающих, микроорганизмов и вирусов экстракцией фенолом и водой при комнатной температуре, так как при этом белки и дезоксирибонуклеиновые кислоты выпадают в осадок, активность рибонуклеазы подавляется и высокополимерные продукты могут быть получены с хорошими выходами. Прямая экстракция дрожжей водным раствором фенола была применена для препаративного получения транспортных РНК.

5.5. Фракционирование

 

Помимо ряда вирусных нуклеиновых кислот, большинство выделенных полирибонуклеотидов, бесспорно, представляют собой сложные смеси, содержащие полимеры с различной длиной цепи, нуклеотидной последовательностью и составом оснований (присутствие или отсутствие «минорных» оснований). Существует ряд приемов для частичного фракционирования, однако, пока не разработаны удовлетворительные методы характеристики, трудно определить степень чистоты или гомогенности рибонуклеиновых кислот. В основу оценки чистоты транспортных РНК, этих сравнительно низкомолекулярных полирибонуклеотидов, может быть положена их ферментативная реакция с аминокислотами (через аминоациладенилаты), что, конечно, позволяет оценить и их биохимическую однородность.

Методы фракционирования включают осаждение нейтральными солями, электрофорез, хроматографию на фосфате кальция и осаждение днгидрострептомицином. Недавно для фракционирования рибонуклеиновых кислот была использована фракционная диссоциация комплексов нуклеиновая кислота — гистон, примененная ранее к дезоксинуклеиновым кислотам. Во всех фракциях отношение 6-амино- к 6-кетонуклеозидам было близко к единице. В некоторой степени фракционирование происходит при экстракции фенолом, возможно как результат дифференциального связывания нуклеиновых кислот с белками. Анионообменные целлюлозы, такие как ЭКТЕОЛА и ДЭАЭ, широко применяются в настоящее время для фракционирования не только рибонуклеиновых кислот, включая специфичные для аминокислот транспортные РНК, но и рибонуклеопротеидов и даже вирусных препаратов. Для элюирования обычно используют растворы нейтральных или близких к нейтральным солеи. Поразительной особенностью метода является способность этих ионообменников к разделению очень широкого спектра веществ, начиная от изомеров мононуклеотидов и олигонуклеотидов с различной длиной цепи или различного состава и кончая полинуклеотидами чрезвычайно высокого молекулярного веса. Опубликовано сообщение о разделении на колонках из ДЭАЭ-декстрана РНК, меченной валином, от немеченой акцепторной РНК. Для фракционирования рибонуклеиновых кислот были также применены модифицированные ионообменные целлюлозы, в которых к целлюлозе с помощью эпихлоргидрина присоединены нуклеозиды (вместо триэтаноламина), особенно аденозин и гуанозин. Подобное использование ЭКТЕОЛА-целлюлозы для фракционирования или выделения информационной РНК, связанной в данный момент с ДНК, основано на способности к специфическому образованию водородных связей: ЭКТЕОЛА связывает денатурированную ДНК данного организма (для элюирования ДНК необходим растворитель чрезвычайно высокой ионной силы), а информационная РНК элюируется растворами понижающейся ионной силы. Посредством хроматографии на трет-аминоалкилированном крахмале транспортная рибонуклеиновая кислота была разделена на фракции на основании повышенного сродства к тирозину и лейцину. Хроматография на оксиапатите дает хорошее разделение рибонуклеиновых кислот, специфичных для валина и фенилаланина.

В другом методе, имеющем значительную потенциальную ценность, используется поперечно сшитый полидиазостирол, полученный в результате реакции полиаминостирола с азотистой кислотой; метод основан на наблюдениях, что соединения дназония легко реагируют с некоторыми аминокислотами с образованием ковалентно связанных производных. В пределах рН от 7 до 8,5 быстро реагируют только тирозин и гистидин. Препараты транспортных РНК, полностью этерифицированные аминокислотами, встряхивали с нерастворимым полидиазостиролом, который реагировал только с нуклеиновыми кислотами, меченными тирозином и гистидином.

Дальнейшая очистка достигалась повторной этерификацией тирозином при использовании очищенного тирозин-активнрующего фермента и повторной обработкой полидиазостиролом. С неэтерифицированной специфичной к гистидину рибонуклеиновой кислотой реакции не происходило, и она оставалась в растворе, в то время как специфичная к тирозину нуклеиновая кислота освобождалась, как и прежде, при обработке щелочью в мягких условиях. Обе фракции получены почти чистыми в отношении их аминокислотоакцепторной специфичности. Предварительные наблюдения по­казали, что специфичная к валину рибонуклеиновая кислота, впол­не вероятно, может быть этерифицирована дипептидом тирозилвалином.


Информация о работе «Химия наследственности. Нуклеиновые кислоты. ДНК. РНК. Репликация ДНК и передача наследственной информации»
Раздел: Химия
Количество знаков с пробелами: 69904
Количество таблиц: 2
Количество изображений: 16

Похожие работы

Скачать
91259
2
36

... частью содержится в цитоплазме клеток. Содержание РНК, как правило, в 5-10 раз больше, чем ДНК. Соотношение РНК/ДНК в клетках тем выше, чем интенсивнее в них синтез белка. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислотными свойствами и при физиологических значениях рН несут высокий отрицательный заряд. В связи с этим в клетках организмов они легко взаимодействуют с различными катионами и ...

Скачать
48670
0
4

... остатки, соединяющиеся водородными связями с комплементарными основаниями матричной цепи. Рост синтезирующейся цепи происходит в направлении 3'-ОН — 3'-ОН-концам, антипараллельно матричной цепи. Репликация ДНК приводит к удвоению количества генетического материала клетки и, как правило,— к клеточному делению. Поэтому репликация происходит тем чаще, чем короче время генерации вируса или бактерии и ...

Скачать
258221
0
0

... с агрессивным поведением иммунной системы. 21 Медицинская биотехнология, ее задачи и достижения. Биотехнология представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для ...

Скачать
155883
0
0

... . ЛИТЕРАТУРА: 1.  Курс низших растений //Под ред. М. В. Горленко – М.: Высш. школа, 1981. 2.  Жизнь растений, т. 1–3, - М.: Просвещение, 1974-77. 3.  Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. Биология, т. 1-3. – М.: Мир, 1990. 4.  Н.П.Горбунова , Е.С.Клюшникова, Н.А.Комарницкий. и др. Малый практикум по низшим растениям. – М.: Высш. школа, 1976.  5. Русанов В. А. Низшие растения. Методические указания ...

0 комментариев


Наверх