Определение величины рН

2.1 Определение величины рН.

Величину рН определяли потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01. Для измерений значений рН растворов в температуре отличной от 20^oС, применяли автоматическую компенсацию.

2.2 Метод определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность (ПА) определяли по ГОСТ 20264.2-74 [12]. Субстратом служил 2% раствор казеината натрия, к которому добавляли 2см³ раствора фермента и помещали в ультратермостат при температуре 30^oС. После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку приливали 4см³ раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживали ещё 20 минут при температуре 30^oС. Затем фильтровали в сухие пробирки. К 1см³ фильтрата добавляли 5см³ 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивали и добавляли 1см³ рабочего раствора Фолина. Через 30 минут измеряли оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах с поглощающим свет слоем 10 мм против контроля. За единицу ПА принимают такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30^oС катализировало переход в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 ммолю тирозина (1ммоль тирозина равен 0,181мг).

2.3 Определение коллагеназной активности.

Коллагеназную активность определяли по содержанию оксипролина в смеси, образовавшегося в результате действия фермента на нативный коллаген. С этой целью готовили реактив для окисления: 28,2 г хлорамина Т растворяли в 40см³ воды для получения 0,05М концентрации, добавляли 60см³ ацитат-цитратного буфера с рН 6,0. К 2см³ анализируемой пробы, содержащей 2 - 20 см³ оксипролина, приливали 1мл реактива для окисления, встряхивали и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем в смесь вносили 2 – 1 см³ 4М хлорной кислоты, встряхивали и через 5 минут приливали 3см³ 10% раствора n-диметиламинобензальдегида в метилцеллосольфе. Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150^оС и после охлаждения фотометрировали с зелёным светофильтром на ФЭК-56М (555нм).

Гидролиз коллагена вели в следующих условиях: 20 мг нативного коллагена обрабатывали исследуемым ферментным препаратом в присутствии буферной системы с рН 7,0 так, чтобы общий объём составил 25см³. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37^oС. Контролем служили пробы, инкубированные в тех же условиях, но без фермента, предварительно остановив реакцию внесением 0,5см³ этанола и центрифугированием смеси в течение 15 минут при 6000 ч×мин^-1.

Активность коллагеназы выражали либо в ммолях оксипролина на 1 мг белка за 60 минут, либо в процентах растворения.

2.4 Определение молекулярной массы фермента.

Молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе У-100. Расчёт проводили по формуле:

LgM=5,941-0,847 (V/V₀),

где V – объём выхода фермента;

V₀ – свободный объём колонки.

2.5 Определение содержания аминного азота.

Метод основан на образовании цветного комплекса при взаимодействии аминогрупп аминокислот с гидроксидом меди. В пробирку, содержащую 100 мг сухого медного реактива, вносили 4см³ анализируемой пробы, предварительно нейтрализованной сухим бикарбонатом натрия, выдерживали 15 минут периодически встряхивая. Затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. В контроле вместо 4см³ пробы присутствовало 4см³ дистилированной воды. Содержание аминного азота рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для известных аминокислот.

2.6 Электрофоретические исследования.

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов.

Электрофорез проводили по методу Дэвиса на приборе фирмы Reanol (Венгрия) в щелочной буферной системе, рН 8,9. Концентрация акриламина в мелкопористом геле составила 5%. Длина мелкопористого геля в трубочке составила 5,5 см. Растворы для полимеризации готовили обычным способом. Исследуемый образец, содержащий 20 – 30 мкг белка смешивали в соотношении 1 : 1 с 40% раствором сахарозы и наносили на трубочку с гелем. Объём образца не превышал 0,2 см³. Поверх образца осторожно наслаивали электродный буфер, который содержал в 1 л 0,6 г трис-(гидроксиметил)-амино-метана и 2,88 г глицина.

В верхний резервуар прибора вносили 1 см³ 0,001% раствора бромфенолсинего для контроля за движением фронта подвижных ионов. В первые 10 – 15 минут сила тока составила 1мА на трубочку, а затем 2,5мА. После окончания электрофоретического разделения гели вынимали из трубочек и проводили окрашивание. Окрашивание проводили раствором амидочерного с массовой долей 0,5, приготовленного с массовой долей 7 уксусной кислоты. Окрашивание проводили 20 – 30 минут. Краситель отмывали с массовой долей 7 уксусной кислотой с многократной сменой раствора.