Матеріали досліджень

2.1 Матеріали досліджень

Обєктом дослідження являлись:

- виробничі штами: E.coli M17 (препарат “Колибактерин”) та B.cereus IP 5832 (“Бактисубтил”).

Препарат “Колибактерин сухой” (Colibacterinum siccum) представляє собою ліофілізовану мікробну масу живих кишкових паличок - штам E.coli М17, виготовлений Київським підприємством з виробництва бактерійних препаратів “Біофарма”. Випускається у флаконах. Одна доза містить 1*10МК.

“Бактисубтил” (Bactisubtil) – кожна капсула препарату містить 1млрд. спор бактерій культури B.cereus IP 5832. Фірма-виробник Hoechst Marion Roussel.

- колекція свіжевиділених та музейних тест-культур (включаючи набір тест-штамів, які використовуються при контролі антагоністичної активності пробіотиків: Shigella sonnei 2802, 5063 Shigella flexneri 337, 170; Escherichia coli 157; Proteus vulgaris 177; Proteus mirabilis 24а, 249; Staphylococcus aureus 209): 24 клінічних штами роду Shigella (збудники дизентерій); 26 клінічних штамів – представників патогенної та умовно патогенної мікрофлори людини (родів Escherichia, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter, Proteus); 4 колекційні штами (Staphylococcus epidermidis) та 11 музейних штамів, які були люб`язно надані нам для проведення досліджень Київським науково-дослідним інститутом епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В. Громашевського (КНДІЕІХ), за що висловлюємо вдячність.

2.2 Методи дослідження культурально-біохімічних властивостей штамів

Дослідження культуральних і ферментативних властивостей штамів продуцентів проводили загальноприйнятими методами, використовуючи диференціально-діагностичні середовища (середовище Ендо, Левіна, Плоскірева, Сабуро, КА,Цейсслера).

2.3 Метод визначення антагоністичної активності мікроорганізмів

Для оцінки явища мікробного антагонізму окремих компонентів та композицій пробіотичних продуктів, а також офіціальних препаратів-пробіотиків в умовах in vitro використовували відповідні методики [68]. Антагоністичну активність визначали по відношенню до патогенних та УПМ з колекції живих культур лабораторії загальної мікробіології КНДІЕІХ і до клінічних ізолятів, виділених із обстежених осіб, використовуючи метод відстроченого антагонізму.

Тест-культури

З метою оцінки антагоністичної активності виробничого штаму використовують тест-культури, які повинні знаходитись в S-формі клітинного циклу, володіти типовими морфологічними, серологічними, біохімічними властивостями і вірулентністю, яка визначається для мікробів кишкової групи величиною LD50 при внутрішньочеревному заражені білих мишей; для шигелл Флекснера повинна бути не більше 250 млн МК при зараженні суспензії живих мікроорганізмів в 0.9% розчині хлориду натрію або не більше 20 млн МК при зараженні в 0.4% голодному агарі; для S. sonnei - не більше 50 млн МК при зараженні в 0.9% розчині хлориду натрію; для штамів Proteus - не більше 350 млн МК в 0.9% розчині хлориду натрію і 30-50 млн МК в 0.4% голодному агарі.

Тест-культури шигелл Флекснера і Зонне повинні давати позитивну кератоконюктивну пробу у морських свинок.

Тест-культури стафілококу повинні володіти наступними властивостями: утворювати зону гемолізу розміром (3-5) мм через (19±1) годин росту на МПА з 0.5% крові (людини, барана, кроля), розлитому в чашки Петрі шаром (2-3) мм; коагулювати плазму крові кроля на протязі (2±1) годин; викликати некроз при підшкірному введенні 200 млн МК добової культури в 0.2 см3 0.9% розчину хлориду натрію кролям вагою (1.5±0.2) кг на протязі 48-72 годин.

Антагоністичну активність штамів перевіряли до таких музейних штамів як S.flexneri, S.sonnei, ентеропатогенних E. coli, S.aureus, Proteus vulgaris i Proteus mirabilis (стандартних тест-штамів, які використовуються для контролю антагоністичної активності пробіотиків) та клінічних ізолятів. Стандартні тест-штами ідентифіковані по тестам сучасної класифікації, мають певні властивості, які визначають їх видову характеристику.

Виробничі штами повинні володіти високою антагоністичною активністю по відношенню до всіх вказаних тест-культур. Зони відсутності росту тест-культур повинні бути не менше 10 мм.

Музейні культури мікроорганізмів перед використанням активізували із ліофілізованого стану перенесенням в середовище м`ясо-пептонного бульйону (3-5 мл на одну ампулу), інкубували при 37ºС 1-3 доби та після одержання густої суспензії мікробних клітин переводили на агаризоване середовище (МПА).

Для визначення антагонізму виробничих штамів використовували метод препендикулярних штрихів на твердому поживному середовищі, сутність якого полягала в наступному: на підсушені чашки Петрі із середовищем МПА по діаметру петлею діаметром (3,50,5)мм висівали штрихом суспензію двохдобової культури пробіотичних мікроорганізмів в концентрації 1 млрд МК в 1мл ізотонічного розчину NaCl. Посіви інкубували в термостаті при (371)ºС. Через 2 доби перпендикулярним штрихом до отриманої полоси росту відступив на 1-2мм підсіювали суспензію однодобових культур тест-штамів мікроорганізмів в концентрації 10 МК в 1 мл. Досліди проводили в 3-х повторюваннях. Результати враховували через 18год інкубування за величиною зон пригнічення росту тест-штамів (вимірюючи ці зони лінійкою: від дослідженої культури до початку росту тест-культури в мм). Контролем росту тест-культур слугував їх паралельний посів штрихом на чашки із тим же середовищем (МПА) без досліджуваної культури. Позитивним вважали результат при відстані затримки росту тест-штаму більший за 7 мм.

В кожному випадку розраховували для кожного тест-штаму середнє арифметичне значення затримки росту та його похибку (Мm).

Похожие работы

Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій на основі дослідження протимікробних властивостей похідних тіазолідину, фурану, хіноліну, акридину і біологічно активних речовин природного походження

Скачать

116279

2

2

... результатів. Анотація Куцик Р.В. Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій на основі дослідження протимікробних властивостей похідних тіазолідину, фурану, хіноліну, акридину і біологічно активних речовин природного походження. – Рукопис. Дисертацiя на здобуття наукового ступеню доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мі ...

Чутливість деяких патогенних мікроорганізмів до антибіотиків цефалоспоринів ІІІ покоління

Скачать

101233

7

0

... . Основний механізм резистентності Haemophilus influenzae до β-лактамних антибіотиків полягає в продукуванні β-лактамаз, які гідролізують амінопеніциліни та цефалоспорини І покоління. Решта β-лактамних антибіотиків, як правило, зберігають високу активність по відношенню до цього збудника. За даними дослідження PROTEKT, проведеного в 20 країнах світу в 2001-2006 рр., у середньому ...

Мікробний антогонізм як основа використання антибіотиків

Скачать

46055

1

1

... кроорганізмів або викликати їх загибель. Цілком імовірно, що і це формулювання з подальшим прогресом антибіотичної науки буде уточнюватися. В перші роки після відкриття антибіотиків їх одержували з використанням методу поверхневої ферментації. Цей метод полягав у тому, що продуцент вирощували на поверхні поживного середовища у плоских суліях (матрацах). Щоб одержати помітні кількості антибіотика, ...

Основи мікробіології

Скачать

128862

4

1

... живлення, дихання, ріст і розвиток, розмноження, реакції на зовнішні подразники, пластичність, інтенсивність взаємодії з факторами середовища. Фізіологія являється науковою основою промислового використання мікроорганізмів у мікробіологічних виробництвах біологічно активних речовин (БАР), ферментів, вітамінів, антибіотиків, амінокислот, органічних кислот. Мікроорганізми здатні до синтезу ...