Методы клинической вирусологии

Курсовая работа

на тему:

"Методы клинической вирусологии"

Введение

Лабораторную диагностику вирусных инфекций проводят в основном с помощью электронной микроскопии, чувствительных культур клеток и иммунологическими методами. Как правило, для постановки диагноза выбирают какой-либо один метод в зависимости от стадии вирусной инфекции. Так, например, все три подхода могут оказаться полезными при диагностике ветряной оспы, однако успешное применение микроскопии и метода культуры клеток зависит от возможности сбора удовлетворительных образцов на относительно раннем этапе заболевания.

В большой степени успех вирусной диагностики зависит и от качества полученных образцов. По этой причине сами сотрудники лаборатории должны принимать непосредственное участие в сборе необходимых образцов. Характеристики образцов, а также способы их доставки в лабораторию описаны Леннетом, Шмидтом, Кристом и др.

Большинство реактивов и инструментов, используемых в лабораторной диагностике, можно приобрести у различных фирм. В большинстве случаев один и тот же реактив выпускается одновременно несколькими фирмами. По этой причине мы не указывали отдельные фирмы, кроме тех случаев, когда реактив поставляется только одной фирмой. Во всех остальных случаях следует обратиться к общему перечню поставщиков, указанных в табл. 1.

Мы не ставили своей целью всестороннее описание всех имеющихся в настоящее время методов диагностики вирусных инфекций человека. Прежде всего мы охарактеризовали основные методы. По мере накопления опыта самостоятельной работы эти основные методы можно будет использовать для решения более сложных задач.

1.   Электронная микроскопия

Для электронно-микроскопической диагностики вирусных инфекций можно использовать тонкие срезы пораженной ткани. Чаще всего материалом для электронной микроскопии служат фекалии или жидкость

Таблица 1. Список фирм, поставляющих реактивы и оборудование

Flow Laboratories: Gibco Europe: Tissue Culture Services: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK

везикул, характеризующих некоторые болезни, например ветряную оспу. При анализе такого материала вирусы можно обнаружить с помощью негативного окрашивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона электронно-плотным материалом. Метод эффективен при высокой концентрации вируса в исследуемых образцах, как, например, в фекалиях или везикулярной жидкости. В тех случаях, когда содержание вирусных частиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса можно увеличить, концентрируя вирус ультрацентрифугированием или агрегируя его специфическими антителами. Последний метод удобен и для идентификации вирусов. Здесь мы опишем электронно-микроскопический метод диагностики ротавирусной инфекции и метод иммуноэлектронной микроскопии на примере обнаружения специфических антител к парвовирусам. Более подробно методы электронной микроскопии изложены Филдом.

2.1 Прямое электронно-микроскопическое исследование фекалий

1. Конец пастеровской пипетки погружают в фекалии и набирают достаточное количество материала для получения мазка размером 1 см.

2. Ресуспендируют фекальный мазок в электронно-микроскопической краске для негативного контрастирования до получения полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контрастирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде.

3. Для получения электронно-микроскопического препарата капельку суспензии помещают на сетку для электронного микроскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой. Во время этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.

4. Препарат оставляют на воздухе на 30 с.

5. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю стекла фильтровальной бумагой.

6. Препарат высушивают на воздухе.

7. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсивностью 440 000 мкВт-с/см². При этом используют коротковолновую ультрафиолетовую лампу с фильтром. Лампа должна находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения каждой стороны — 5 мин.

8. Вирионы ротавирусов можно охарактеризовать под трансмиссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000 до 50 000.

2.2 Иммуноэлектронная микроскопия

Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии представляет собой только один из множества подобных иммунологических методов. Для исследования вирусоспецифических антител, кроме того, используют метод, предполагающий связывание с микроскопической сеткой белка А. Рабочую концентрацию антивирусных антител определяют методом проб и ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами концентрация, как правило, используется в рутинной работе. Для получения оптимальных результатов взаимодействия антител с вирусом таким же образом титруют сыворотку, содержащую парвовирус.

1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.

2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.

3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.

4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.

6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус.

7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.

8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.

9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.

10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.

Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.

3. Идентификация вирусных антигенов

Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях, можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам с помощью реакции антиген — антитело. Продукт реакции антиген — антитело тестируют по метке, которую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела, либо в антитела, направленные против вирусоспецифических антител. Антитела можно пометить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того, для идентификации вируса используют реакцию гемагглютинации. В повседневной практике описанные методы применяют главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих различные респираторные заболевания.

В настоящее время многими фирмами выпускаются эритроцитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы, в том числе для обнаружения вируса гепатита В. Мы не считаем целесообразным излагать методы работы с указанными диагностикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструкциям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе идентификации респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях.

3.1 Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции

Метод получения препаратов носоглоточных выделений описан Гарднером и Мак-Квилином. В лабораторных условиях эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные мазки можно хранить в фиксированном состоянии при —20 °С в течение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуоресценции.

3.1.1 Приготовление препаратов носоглоточных выделений

1. Слизь со специальных щипцов смывают 1—2 мл PBS и переносят в центрифужную пробирку.

2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

3. Надосадочную жидкость сливают.

4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2—3 мл PBS до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-рокогорлую пастеровскую пипетку.

5. Полученную суспензию переносят в пробирку.

6. К суспензии добавляют еще 2—4 мл PBS и перемешивают пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.

7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от стенок пробирки.

9. Полученную суспензию наносят на размеченное предметное стекло.

10. Стекло подсушивают на воздухе.

Фиксируют в ацетоне 10 мин при 4°С.

12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.

13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо хранят при —20 °С.

3.1.2. Методика окрашивания

1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисыворотку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.

2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат.

3. Препарат помещают во влажную камеру.

4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.

5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител в специальном резервуаре.

6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин в каждой.

7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.

8. Распечатывают и разводят конъюгированные с флуоресцеином антитела до нужной концентрации.

9. На препарат наносят каплю разведенных флуоресцирующих антител.

10. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.

Препарат трижды промывают PBS.

12. Промывают 2 мин в дистиллированной воде.

13. Осторожно удаляют избыток дистиллированной воды и высушивают на воздухе.

14. Используя иммерсионное масло, препараты исследуют под флуоресцентным микроскопом. Покровное стекло и заключение препарата не требуются.

3.1.3 Интерпретация результатов

О присутствии антигенов РСВ свидетельствует флуоресценция цитоплазмы отдельных клеток. Необходимо сравнивать исследуемые препараты с контрольными, как заведомо положительными, так и заведомо отрицательными.