Навигация
Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи методом «захвата» антител
42319
знаков
3
таблицы
7
изображений
5.4 Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи методом «захвата» антител
Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет важное значение при постановке диагноза первичной и врожденной инфекций. Существует множество методов определения и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти методы заменены чисто иммунологическими методами, которые не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два основных варианта этих методов. Первый предполагает идентификацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса краснухи связывают с поверхностью пластика, инкубируют его с сывороткой пациентов, а затем с меченными антителами против IgM человека, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после каждой стадии проводить тщательную отмывку, то оставшаяся метка укажет на присутствие специфических IgM.
Альтернативным методом является метод «захвата» антител, при котором твердую фазу вначале связывают с антителами к IgM человека. Промывают и инкубируют с тестируемой сывороткой, что приводит к «захвату» содержащихся в ней IgM. Последующая инкубация с антигеном краснухи позволяет отобрать все специфические IgM. После очередной промывки связавшийся с твердой фазой антиген вируса краснухи выявляют в реакции с меченными антителами к вирусу краснухи.
Последние антитела — антитела-детекторы — могут быть помечены радиоактивным 1251 или связаны с ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Ниже мы опишем метод, основанный на использовании радиоактивных изотопов, поскольку он хорошо разработан и применяется в большинстве лабораторий. В качестве меченых антител в настоящее время широко используют мышиные моноклональные антитела, однако, к сожалению, они не всегда доступны. При необходимости мы советуем связаться с местной вирусологической лабораторией, которая смогла бы обеспечить вас моноспецифической сывороткой высокого титра. В противном случае сыворотка может быть получена стандартными методами или с помощью гибридомной технологии. Полученные антитела легко пометить иодом, как описано ранее {6]. Однако в последнее время все более популярным становится иммуноферментный метод. В частности, фирмой Rubenz-M производится коммерческий набор реагентов для метода «захвата» IgM, специфичных к вирусу краснухи. Кроме того, можно отдельно заказать моноклональные антитела к вирусу краснухи, конъюгированные с ферментом.
5.4.1 Подготовка полистироловых гранул
1. В контейнер помещают полистироловые гранулы, которые заливают кроличьей антисывороткой к, разведенной в 500 раз в 1 н. НС1.
2. Гранулы встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед употреблением гранулы должны быть выдержаны на холоду не менее 48 ч.
3. Для мелкомасштабных экспериментов гранулы разливают по 12-мм пробиркам из полистирола. Гранулы промывают в специальном сосуде, удаляя жидкость пастеровской пипеткой, присоединенной с помощью вакуумного шланга к водоструйному насосу. Описанные выше процедуры могут быть значительно упрощены при использовании специальных систем фирмы Abbott Diagnostics Ltd.
5.4.2 Тестирование
1. Отбирают требуемое количество гранул, отсасывают НС1 и покрывают гранулы PBSA с 1% БСА. Суспензию инкубируют 3 ч при комнатной температуре.
2. В лунки или пробирки, используемые для тестирования, разливают по 200 мкл PBSA с 0,05% твин 20, затем в них добавляют по 5 мкл исследуемых и контрольных сывороток. Смешанный препарат сывороток от 4—8 недавно выздоровевших больных принимают за 100 условных единиц IgM, специфичных к вирусу краснухи. Положительные контроли, содержащие 40, 10, 3,3 и 1 условных единиц, получают, разводя смешанную сыворотку заведомо отрицательной человеческой сывороткой. Они используются в каждом тестировании для построения стандартной калибровочной кривой. Кроме того, в каждый опыт необходимо включать отрицательный контроль.
3. В каждую лунку или пробирку с приготовленным 40-кратным разведением тестируемых и контрольных сывороток добавляют гранулы, покрытые сывороткой кролика против ц-цепей IgM человека. Образцы инкубируют 3 ч при 37 °С.
4. Гранулы трижды промывают PBST, а затем инкубируют с 200 мкл ГА-антигена вируса краснухи, разведенного в 10 раз в PBST. Образцы инкубируют 18—24 ч при 4°С. После инкубации гранулы трижды промывают в PBST.
5. В каждый образец добавляют по 200 мкл антител-детекторов, меченных 1251 и разведенных до 50 000 имп/мин на 200 мкл. Для разведения используют PBS с 2% твин 20, 20% кроличьей сыворотки и 10% заведомо отрицательной человеческой сыворотки.
6. Гранулы промывают четыре раза PBST и определяют радиоактивность с помощью счетчика. Далее усредняют результаты параллелей, вычитают счет фона и строят калибровочную кривую. Данные по контрольным сывороткам наносят на логарифмическую бумагу. Количество относительных единиц в исследуемых сыворотках определяют, сравнивая построенную калибровочную кривую со стандартной калибровочной кривой.
5.4.3 Интерпретация полученных результатов
Сыворотка, содержащая 3,3 условной единицы и более 3,3, считается положительной. Данный результат свидетельствует о недавно перенесенной или врожденной инфекции. Сыворотка, содержащая менее 1 условной единицы, считается отрицательной. Сыворотка, содержащая от 1 до 3,3 условной единицы, не может считаться ни положительной, ни отрицательной. В этом случае диагноз ставится с учетом клинической картины заболевания. Как правило, такие сыворотки все же рассматриваются как отрицательные. Тем не менее, они могут свидетельствовать об инфекции, перенесенной ранее.
Похожие работы
екул ДНК на матрице молекулы РНК. За это открытие они получили Нобелевскую премию. Д.И. Ивановский по праву считается основателем науки вирусология. Д.И. Ивановский открыл вирусы – новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вирусов, цитопатология вирусных инфекций, фильтрующихся форм микроорганизмов, ...
... авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов — ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чистых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогтом, модифицировали, и в настоящее время есть ...
... JgD являются аутоиммунными антителами, так как при аутоиммунных заболеваниях (например, красная волчанка) их количество в сыворотке крови больных увеличивается в сотни раз. Раздел «Частная микробиология и вирусология» Вопрос 6. Возбудитель холеры: биологическая характеристика, среда обитания, источники, пути и механизмы инфицирования; факторы патогенности; принципы лабораторной диагностики; ...
... простатитом, тогда как при острых уретритах обнаруживают мало паразитов - в основном атипичные амебоидные формы[7,10,14,15,19]. 1.4.2 Культуральное исследование Служит важным звеном лабораторной диагностики трихомоноза у мужчин и женщин, особенно при распознавании атипичных форм паразитов и выявлении их у лиц, получавших противотрихомонадные препараты при трихомонадоносительстве. ...
0 комментариев