Фагоцитоз

Функциональное состояние фагоцитов в большинстве случаев определяется
по фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови или клеток,
выделенных из головного, туловищного отделов почек и селезенки. Существуют
разнообразные методические приемы количественной оценки фагоцитарной
активности лейкоцитов. Одни основаны на подсчете числа фагоцитов с
захваченными чужеродными телами под микроскопом, другие - на регистрации
интенсивности проявления кислородзависимой антиинфекционной системы в
реакции хемилюминесцснции или по способности фагоцитов восстанавливать
растворимый краситель нитросиний тетразолий в нерастворимый диформазан
(НСТ-тест). Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro и in vivo в
отношении микроорганизмов основано на учете фагоцитов под световым
микроскопом. Хсмилюминесцентный метод определения фагоцитарной
активности клеток требует специального дорогостоящего оборудования и
компьютерной техники. Способ определения фагоцитарной реакции лейкоцитов
по НСТ-тесту более трудоемкий, чем основанный на использовании тест-
микроорганизмов. Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении
микробов в практике лабораторных исследований чаще всего проводится in vitro и
in vivo. В качестве тест-микробов рекомендуется использовать
грамположителъные и грамотри-цательные микробы: staphilococcus aureus,
acromonas hydrophila и saccharomyces cerevisiae.

2.1.2.1. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro по
Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947).

Принцип метода. Указанный метод основан на учете соотношения числа
лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе, и общего числа клеток белой крови.
- Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; пипетки стерильные на
1,0 мл; пастеровские пипетки стерильные; 0,65%-ный стерильный раствор натрия
хлорида; 2%-ный стерильный раствор натрия цитрата; водяная баня,
отрегулированная на 60°С; объект фагоцитоза -одномиллиардная взвесь суточной
культуры бактерий a. hydrophila, инактивированных при 60°С в течение 30 минут,
приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат
отрегулированный на 26°С; предметные стекла; шли4юваннос стекло; набор для
окраски мазков крови; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром ]: 1;
рабочий раствор красителя азур-эозина; иммерсионное масло;
микроскоп.
- Материал для исследования, ход определения и учет результатов. В
пробирку вносят 0,1 мл 2%-ного стерильного раствора натрия цитрата, (,|,2 мл
свсжевзятой крови от обследуемой рыбы, 0,2 мл объекта фагоцитоза. Взвесь
осторожно, но тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре
26°С (для теплолюбивых рыб) и более низкой (для холодолюбивых). Через 15 и 30
минут, 1; 1,5 и 2 часа с момента тер-мостатирования пастеровской пипеткой
забирают смесь из пробирки, помещают на предметное стекло и делают мазки,
которые фиксируют в течение 10 мин. смесью спирта с эфиром (1:1) или в течение
5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим рас-
твором азур-эозина. После этого их просматривают под иммерсией (ок.7.x об.90).
Подсчитывают 100 (иногда 50) лейкоцитов. Захватывающую способность
лейкоцитов выражают двумя показателями: процентом фагоцитоза - процентным
отношением лейкоцитов, захвативших тест-микробы, к общему числу
подсчитанных, и фагоцитарным индексом - количеством тест-микробов,
захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом.

2.1.2.2. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vivo по
Г.Д.Гончарову (1966)
- Принцип метода заключается в исследовании реакции фагоцитоза
лейкоцитов в брюшной полости рыб. Анализ фагоцитарной реакции, проводится
через 15, 30, 60, 90 и 120 мин, с момента введения микроорганизмов
- Оборудование и реактивы: шприц и инъекционные иглы; 0.65%-ный
стерильный раствор натрия хлорида; водяная баня, отрегулированная на 60°С;
одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий А. hydrophila,
инактивированной при 60°С в течение 30 мин.; термостат, отрегулированный на
26°С; пастеровские пипетки стерильные; предметные стекла; шлифованное стекло;
метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор азур-
эозина; иммерсионное масло; микроскоп.

- Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Рыбам
между брюшными плавниками внутрибрюшинно вводят указанное количество
инактивированных микробных тел на 0,65%-ном стерильном растворе натрия
хлорида, помещают их в аквариум и через 15 и 30 мин., 1, 1.5 и 2 часа с момента
введения объекта фагоцитоза у рыб пастеровской пипеткой отбирают из места
укола брюшной экссудат, наносят на предметные стекла и делают мазки.
Полученные мазки фиксируют в течение 10 мин, смесью спирта ректификата с
эфиром (1:1) или в течение 5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в
течение 20-40 мин. рабочим раствором азур-эозина и исследуют под микроскопом
(ок.7 х об.90). Подсчитывают 100-200 лейкоцитов. Оценку проводят аналогично
методу Е.А. Коста и М.И. Стенко.