Гуморальные факторы

3.2. Гуморальные факторы

3.2.1. Имуноглобулины. Они являются биохимической основой
специфического гуморального иммунитета, выполняют функцию специфических
антител к конкретным антигенам, синтезируются плазматическими клетками (В-
лимфоцитами) и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная их
часть относится к гамма - глобулиновой фракции сыворотки крови.

Методы определения содержания в организме рыб иммуноглобули-нов
основаны на оценке содержания гамма-глобулинов в сыворотке крови или других
биологических жидкостях. Простыми и доступными приемами исследования
гамма-глобулинов в сыворотке крови и других жидкостях являются методы
электрофореза, хроматографии на анио-нообменниках, осаждения насыщенными
растворами фосфатов или сульфатов. Существуют также иммунологические
методы определения содержания гамма-глобулинов у рыб с помощью
антисывороток.

 Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови рыб по гамма-
глобулину методом осаждения.

Принцип метода. При взаимодействия с насыщенными растворами
фосфатов, определенной концентрации гамма - глобулины осаждаются. изменяя
тем самым оптическую плотность исследуемого образца. Определение
производится параллельно с другими фракциями сыворотки крови (альбуминами,
альфа и бета-глобулинами), по изменению оптической плотности (ОП) на ФЭКе.

Оборудование и реактивы. ФЭК, химические пробирки, пипетки на !. 2, 5, 10
мл, бюретка на 100 мл, мерные колбы на 100 и 500 мл, холодильник, сыворотка
крови, фосфатные растворы (основной и рабочий), штативы для пробирок.

Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Вначале
готовят основной фосфатный раствор: 335 г гидроокиси натрия растворяют в 400
мл дистиллированной воды, добавляют 226,8 г фосфорнокислого калия
однозамещснното. После растворения охлаждают до комнатной температуры и
добавляют дистиллированную воду до объема 500 мл, затем готовят рабочие
фосфатные растворы для осаждения каждой (фракции белков. Берут 4 мерных
колбы на 100 мл, которые нумеруют соответственно n 1, 2, 3 и 4. В каждую колбу
вносят строго определенное количество основного фос4)атного раствора: 92,4 мл -
n 1, 74,9 мл - n 2. 58,8 мл - n 3, 48,7 мл - n 4 и до метки 100 мл доливают
дистиллированную воду. После этого рабочие растворы в колбах тщательно разме-
шивают путем встряхивания (при хранении добавляют i каплю хлороформа на 100
мл раствора). После приготовления (фосфатных растворов приступают к
определению белковых фракций в исследуемых образцах. На каждую пробу
сыворотки крови берут 6 пробирок и нумеруют: 0. 1, 2, 3, 4, 5. В пробирку под
цифрой 0 вносятся 10 мл дистиллированной воды, в пробирки под номерами 1, 2, 3
и 4 - по 5 мл соответствующих этим цифрам рабочих фосфатных растворов. В
пробирку n5 вносят 0.5 мл исследуемой сыворотки крови, 0.75 мл
дистиллированной воды и 3.75 мл основного фосфатного раствора, пробирку
закрывают пробкой и перемешивают путем перевертывания ее 5-6 раз, после чего
из этой пробирки переносят по 0.5 мл смеси в пробирки n i, 2, 3, 4 и 1 мл в
пробирку под номером 0 (контроль). Содержимое пробирок тщательно и осторожно перемешивают, избегая образования пены и пузырьков воздуха и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. По истечении указанного срока осуществляют измерение ОГГ растворов в пробирках n 1, 2, 3, 4 против контроля (n 0) на ФЭКс при красном
светофильтре в кювете с длинной оптического пути 1 см. Определение оптической плотности проводится сначала в пробирке n4, затем в пробирках n 3, 2 и 1.
Расчет результатов  производится по схеме: ОП пробирки n1 - ОП пробирки n2 = ОП альбуминов; ОП пробирки n2 - ОП пробирки n3 = ОП альфа-глобулинов;
ОП пробирки n3 - ОП пробирки n4 = ОП бета-глобулинов;
ОП пробирки n4 = ОПгамма-глобулинов.

Принимая сумму ОП альбуминов и всех глобулиновых 4>ракций за 100%
(ОП пробирки n1), вычисляют долю содержания каждой фракции в процентах.
Процентное содержание гамма-глобулинов определяют по (формуле:
Относительное содержание гамма-глобулина, % = ОПкк х 1 ()(). где:
ЮП
ongg - гамма-глобулина (ОП - пробирки n 4), ?0n - сумма ОП всех белковых
фракций (ОП пробирки n 1), 100 - коэффициент перевода содержания гамма-
глобулина в %. Зная концентрацию общего белка в единице объема можно
произвести перерасчет в абсолютные величины. Ошибка метода составляет + 4%.

3.2.2. Антитела

Антитела представляют собой сывороточные белки, синтезируемые В-
лимфоцитами при попадании в организм антигена или чужеродных тел и
вступающие с ними во взаимодействие. Главными свойствами антител являются
специфичность и гетерогенность. Специфичность антител определяется
антигеном, вызывающим их синтез. Рыбы, как и высшие позвоночные,
синтезируют разнообразные по структуре и функции антитела: агглютинины,
преципитины, антитоксины, комплементсвязывающие и вируснейтрализующие
антитела, гемолизины, полные и неполные. Антитела по происхождению
подразделяются на естественные и индуцируемые (образующиеся после
парентерального и энтерального введения антигена). Они являются одной из
информационных структур иммунной системы, выполняющих функцию
иммунологической памяти об антигене. Благодаря высокой специфичности
антитела используются при определении природы антигенов, вызывающих их
синтез, напряженности активно приобретенного иммунитета, характера течения
процесса иммуногенеза и характера влияния благоприятных и неблагоприятных
факторов на иммунную систему рыб. Существуют многочисленные методы определения содержания антител в организме рыб: серологические, иммуноэлектрофоретические, радиоиммунные, иммуноферментные, иммунодиффузныс, лазерные.
Наиболее простыми и общепринятыми методами определения антител в
организме рыб являются: реакция агглютинации, реакция агглютинации дате кс-
антигена (или антител).