Гуморальные факторы

К гуморальным факторам иммунитета рыб относят разнообразные по
структуре и иммунобиологической функции компоненты, входящие в состав
крови, лимфы, тканевых жидкостей, кожной и кишечной слизи:
лизоцим, комплемент, агглютинины (естественные антитела), интсрфе-рон,
лсктины, трансфсрины, лизины, бактериолизины, С-реактивный белок, хитиназа и
т.д.

Ниже приведены методы определения бактерицидных свойств сыворотки
крови (БАСК), комплемента, интерферона и естественных антител или
агглютининов, наиболее объективно отражающих функциональное состояние
иммунной системы и уровень естественной резистент-ности рыб.

2.2.1. Определение бактерицидной активности сыворотки (БАСК)
крови рыб

БАСК отражает функциональное состояние гуморальных факторов защиты
или естественной резистснтности. Данный показатель используют при оценке
характера течения инфекционного процесса, зараженности рыб паразитами и
условий нагула. Для учета величины антимикробных свойств сыворотки крови
рекомендуется использовать радиоуглеродный и фотоэлсктронефелометрический
способы. Поскольку для оценки БАСК радиоуглсродным способом требуется
специально приспособленное для этой цели оборудование рекомендуется
пользовать оптический метод (О.В.Смирнова, Т.А.Кузьмина, 1966),
адаптированный для рыб (Микряков и др. 1979: Зимин, 1983).

Принцип метода основан на учете характера изменения оптической
плотности МПБ или РПБ при росте на нем микробов с добавлением или без
добавления испытуемой сыворотки с помощью фотоэлектрического колориметра
или спектрофотометра.

Оборудование и реактивы: пипетки стерильные на 1,0 мл; МПБ или РПБ
стерильный в пробирках по 2,5 и 3,0 мл или по 5,0 и 6,0 мл; сыворотка крови
исследуемых рыб; одномиллиардная взвесь суточной культуры вирулентных
бактерий a. hydrophila (можно использовать и другие виды микроорганизмов),
приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат,
отрегулированный на 26°С; ФЭК-56М; пастеровские пипетки, шприцы и
инъекционные иглы для взятия крови, стерильные.

Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Оценку
БАСК проводят в течение 1-5 суток от момента взятия крови. Кровь для получения
сыворотки собирают в стерильные пробирки каудоэкгомией, отсечением
жаберных артерий или из кровеносных сосудов хвостового стебля с помощью
пастеровской пипетки или шприца. Полученную кровь отстаивают при комнатной
температуре 20-30 минут. После обведения сгустка крови с помощью стерильной
пастеровской пипетки пробирки ставят в холодильник на 18-24 часа при + 4° С.
Через сутки отделившуюся в пробирках сыворотку пастеровскими пипетками
отсасывают и переносят в стерильные пробирки. Далее сыворотку
центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 10-15 минут и используют для
постановки опыта. В пробирки вносят 2,5 мл МПБ или РПБ и 0,5 мл испытуемой
сыворотки, а в три контрольные пробирки 3,0 мл среды. Затем пастеровской
пипеткой во все пробирки добавляют по 2 капли одномиллиардной взвеси
суточной культуры тест - бактерий. Содержимое пробирок тщательно
перемешивают, отбирают по 3.0 мл смеси и определяют оптическую плотность на
ФЭК. После этого пробы помещают в термостат при 26°С на 3 часа, после чего
вновь измеряют оптическую плотность их содержимого. В пробирках с активной
сывороткой крови оптическая плотность остается на прежнем уровне или
незначительно повышается. При слабой бактерицидной активности сыворотки
оптическая плотность среды возрастает за счет накопления в ней размножающихся
микробов. В контрольных пробирках оптическая плотность среды возрастает.
БАСК выражают через изменения оптической плотности контрольных и
подопытных проб, отражающие угнстсние роста бактерий в присутствии
сыворотки, и рассчитывают по формуле:

БАСК(%) = 100 х -dek ~ de ° ,

 где de, d Ек - разность оптической плотности второго и первого измерений в
контрольных пробирках; deo - разность оптической плотности второго и первого измерений оптической плотности в опытных пробирках.
100-коэффициснт перевода оптической плотности в %.

2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента

В качестве тест-объекта для определения активности комплемента in vitro
используют эритроциты барана (по классическому пути) и эритроциты кролика (по
альтернативному пути).

Активность комплемента обычно выражается в условных единицах. За одну
50 % гемолитическуго единицу (СНад) принимается количество комплемента,
необходимое для 50 %-го лизиса эритроцитов. Эта единица является условной,
поскольку зависит от концентрации эритроцитов, количества сенсибилизирующих
антител (для классического пути), величины ионной силы среды, концентрации
Са^ и mg21, ph, времени и температуры реакции. Для каждого вида рыб
подбираются оптимальные значения этих показателей.

Отношение между количеством взятого комплемента и долей лизи-рованных
клеток нс является линейным, а выражается сигмовидной кривой, для
математического описания которой используется уравнение:

Х = К (y/l-y)17"

где: Х - количество комплемента (мл) в реакции; у - степень лизиса, выраженная в
долях единицы; К -константа, соответствующая ichso при у = 0,5; 1/п-константа
(определяет наклон кривой, зависит от условий опыта).

При логарифмировании этого уравнения получается функция, удобная для
оценки результатов:

igx =lgk+l/n[lg(y/l-y)]

Зависимость величины lg Х от величины lg(y/l-y) графически будет
представлять прямую линию, по которой можно определить искомую величину К.
Зная величину К, легко рассчитать количество chsn, содержащихся в 1 мл
неразведенной сыворотки.

2.2.2.1. Определение гемолитической активности комплемента по
классическому пути активации (метод Мейера в модификации yano Т.,
1992).
- Принцип метода основан на способности комплемента присоеди-
няться к комплексу антиген - антитело (эритроциты барана - гемолизин) и
вьвывать специфический гемолиэ сенсибилизированных эритроцитов.

За единицу активности (по Мейеру) комплемента теплокровных
принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает
50 % лизис 5х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в
желатин - вероналовом буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 mm Са2* и 0,5
mm mg24", в течение 60 мин инкубации при 37° С в объеме 7,5 мл. По
yano Т., в зависимости от вида рыб, инкубацию осуществляют при 20- 25°
С в течение 60-120 мин в желатин-вероналовом буфере (рН 7,3 -7,4),
содержащем 0,5 mm Са2^ и 1 mm mg^ в объеме 1,5 мл. Для сенси-
билизации эритроцитов используют гемолизин того же (или близкого)
вида рыб, что и испытуемый комплемент.

- Оборудование и реактивы: спектрофотометр и кюветы с длиной
оптического пути 1 см (при использовании приборов с иной длиной опти-
ческого пути необходимо определить и использовать в расчетах величину
оптической плотности (od) для заданной концентрации эритроцитов);
рН - метр; водяная баня; дозирующие микропипетки на 0,2; 1, 2 мл; про-
бирки (5-10 мл), выдерживающие центрифугирование; рефрижераторная
центрифуга; стерильные шприцы; глюкоза; naci; дистиллированная вода;
na-5,5,- диэтилбарбитурат (мединал); cacl2; mgcl2; желатин; in hc1;
ледяная уксусная кислота; ацетат натрия; edta; 10 % МаЖ)з; эритроциты
барана в растворе Олсвера (1:1); гемолизин;сыворотка крови рыб (источник комплемента); 0.85% naci; маточный раствор солей (СаСЬ х 2НгО - 7.35 г, mgcl-i x 6h20 - 20.33 г, дистиллированная вода до 100 мл).

- Приготовление буферных растворов:

- Вероналовый буфер, концентрат, рН 7,3-7.4 (5vb): naci - 41,5 г,
Ма-5,5-диэтилбарбитурат - 5,1 г, in hc1 - 17.5 мл, дистиллированная вода -1 л. Желатин-вероналовый буфер (gvb^): желатин - 0,1 г, 5vb - 20 мл,
маточный раствор солей - 0,1 мл, дистиллированная вода до 100 мл
(хранить при +4°С не более 1 недели) Глюкозо-желатин-вероналовый буфер (ggvb24): желатин - 0.1 г, 5vb - 10 мл, глюкоза - 2,5 г, маточный раствор солей — 0,1 мл, 10%
nanos - 0,2 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4° С не
более 1 недели). - 0,1 М edta буфер, рН 7<5: 2Д2 г edta растворить в 90 мл дистиллированной воды, добавляя концентрированный раствор naoh, довести рН до
7.5, долить дистиллированной воды до 100 мл. - 0,01 М edta-желатин-вероналовый буфер (edta - gvb): желатин - 0,1 г, 5 vb - 20 мл, 0,1 М edta (рН 7,5) - 10 мл, дистилированная вода до 100 мл ( хранить при +4° С не более 1 недели). 0,001 М ацетатный буфер, рН 5,0: смешать 3 части 0,1 М уксусной кислоты
с 7 частями 0,1 М ацетата натрия, развести в 100 раз, довести рН до 5,0.

- Получение гемолизина.

- Рыба. Для иммунизации используют неполовозрелую рыбу из благополучного хозяйства. Рыбу предварительно адаптируют и содержат в условиях
наиболее оптимальных для каждого вида (температура воды, проточность,
аэрация, полноценное кормление).

- Приготовление стромы эритроцитов барана. 100 мл крови барана в растворе
Олсвера (1:1) центрифугируют при 500-1000 g 10 мин (+ 4° С) и дважды отмывают
200 мл физраствора. Осадок эритроцитов лизируют в 1 л дистиллированной воды,
содержащей 0,4 мл ледяной уксусной кислоты, в течение ночи при +4° С.
Центрифугируют, затем осадок стромы промывают б раз 0,0б1 М ацетатным
буфером (рН 5,0) и 1 раз физраство-ром, центрифугируя 20 мин. при 500-1000 g.
Осадок тщательно ресус-певдируют в 30 мл физраствора. В суспензии определяют
содержание азота микромстодом Кьельдаля и доводят концентрацию до 1 мг/мл.
- Иммунизация рыб. Рыбу инъецируют в/б суспензией стромы эритроцитов
из расчета 0,3-0,5 мг n/кг массы рыбы. Инъекций повторяют многократно (6-8 раз)
с интервалом 5 дней. Перед каждой инъекцией (начиная с 4-5) отбирают
сыворотки и определяют титр гемодизина. Количество инъекций зависит от титров
полученных гемолйзинов (определение тетрагемолизина см. ниже).
- Отбор антисывороток и условия хранения. Через 5 дней после последней
инъекции стерильно отбирают максимальное количество крови. После
образования и ретракции сгустка центрифугируют 5 мин при 1500 g. Отбирают
сыворотки и разводят 1:1 gvb2^ инактивируют прогреванием (карповые-20 мин
при 50° С, лососевые - 20 мин при 42-45°С), расфасовывают и хранят при -20° С и
ниже.
- Определение титра гемолизина. Готовят серийные 2-х кратные разведения
антисывороток gvb2^ К 0,5 мл каждого разведения антисыворотки добавляют по
0,1 мл эритроцитов барана (1х109 кл/мл, см. ниже), по 0,4 мл gvb 2+ и по 0,5 мл
комплемента, разведенного gvb2^ 1:20-1:40 (в качестве комплемента используют
свежую сыворотку, полученную от интактных рыб того же вида). Смесь
инкубируют при 20 - 25° С в зависимости от вида рыб (карповые - 25°С - 60 минут,
лососевые - 20° -120 минут), центрифугируют 5 минут при 1600 g, определяют
оптическую плотность (od541) супернатанта и рассчитывают степень гемолиза. За
титр гемолизина принимают разведение, дающее 50 % гемолиз.
- Получение и условия хранения комплемента. Комплемент рыб очень
термолабилен и быстро инактивируется даже при 0° С (несколько часов), не
переносит замораживания при минус 20° С, при минус 35° С активность
сохраняется в течение месяца. Кровь после отбора оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем на 1 час при 0°С (лед с водой) для ретракции сгустка, центрифугируют 5 мин при 1500 g (0° ...+4° С) и отбирают сыворотки. Сыворотки как источник комплемента используют немедленно, а при необходимости хранят при -80° С или
лиофилизируют.

- Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе
Олсвера (1:1) трижды отмывают edta-gvb и готовят 5% суспензию в gvb2^ К
0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды,
после лизиса эритроцитов измеряют ods4i против дистиллированной воды.
Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует 0d541
0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого
значения od541, значит ее необходимо развести (если od541<0,680) или
сконцентрировать (если od541>0,680) во столько раз, во сколько полученное
ods4i отличается от 0,680.

- Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации
эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют
гемолизин с титром 1:1500 и выше) на gvb2'. Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый
ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все
пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и
инкубируют при 25° С 20 мин. Готовят несколько разведении комплемента на
gvb24 - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб
и активности комплемента (1:15 - 1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл
комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для кар-
па), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии),
периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 16ДО g, определяют od541
и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для
каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от
разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при
гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизнна принимают
максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой
на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая
выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают
разведение 1:400).

- Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное
разведение гемолизина в edta-gvb. Это разведение медленно добавляют (при
постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл
в edta-gvb) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты
отмывают в ggvb2^, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию
эритроцитов в ggvb^ с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя ods4i лизированных клеток (0,2 мл суспензии
сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают ods4i,
равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1
недели.
- Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят gvb24 в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в
область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного
испытуемого комплемента (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводят объем до 1,3
мл, в каждую пробирку добавляют по 0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1 -контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл gvb^); 2 - 100% лизис
эритроцитов (0.2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл
дистиллированной воды); 3 - контроль od.541 комплемента (1.0 мл разведенного
комплемента + 0.5 мл gvb^).

Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура -
оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют
od541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на
контроли. Т.е. от полученного значения od.,41 супернатанта каждой опытной
пробирки вычитают od.s4i контроля эритроцитов и ods4i контроля комплемента
(значение ods^i контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в
которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта
величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента).

В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема
комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической
единице chso Количество СН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

 
М = 0.2 n : К,

 где: n - величина, обратная разведению комплемента; 0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейсру (7.5 мл). Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужнойфорели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ± 76.6. (t.yano, 1992).

2.2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента по
альтернативному пути активации (по yano Т., 1992).

Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно
используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в
присутствии egta (хелатньш агент для Са2^ чтобы блокировать классический
путь активации) и mg2+.

Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тиляпии,
аю, порги, ' желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз
при добавлении в реакционную смесь 0.1 mm ca2^
- Принцип метода основан на способности комплемента активироваться
эритроцитами кролика и лизировать их.
За единицу активности комплемента (АСН5о) принимают такое количество
неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х10 эритроцитов при
20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mМ egta и 10mm mg^ в
объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб
(радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа; карп - рН 7.5, 1.5 часа).
- Оборудование и реактивы; оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза;
дистилированная вода; Ма-5,5-диэтилбарбитурат; mgcl2+2; in hc1;
egta; желатин; naoh; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник
комплемента).

- Приготовление буферных растворов:

- Всроналовый буфер, концентрат (5 vb), см.п, 2.2.2.1.
- 0,1 М egta - mg буфер,: egta - 38 r, mgc12 x 6 Н20 - 20,3 г, naoh – 7
r, дистилированная вода - 1л, доводят рН до 7,5 in naoh.
- 0,01 М egta - mg желатин-вероналовый буфер (egta-mg-gvb):
жедатин-0,1 г; 5 vb-20 мл; 0,1 М egta-mg-10 мл; дистилированная вода до 100
мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С
в течение 1 недели.

- Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в
растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в egta-mg-gvb и готовят суспензию с
концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя odw лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии
эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют od4i4 лизата;
если полученная величина od4i4 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов
необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное