Обзор литературы

1. Обзор литературы

 

1.1 Растительная клеточная стенка

Растительная клеточная стенка была первой субклеточной структурой, увиденной учеными. Именно ее обнаружил в 1665 г. Роберт Гук при наблюдении в микроскоп среза пробкового дерева (см. Полевой, 1989, с. 13). И название «клетка» относилось первоначально именно к этой структуре из-за сходства строения исследуемых под микроскопом частей растений с ячейками («cells») пчелиных сот. Протоплазма была открыта позднее и терминологическая путаница при употреблении слова «клетка» долгое время смущала ученых (Кернер, 1906 с. 26).

В большинстве многоклеточных организмов, клетки погружены в специальный матрикс, который обеспечивает целостность клеток, и оказывает влияние на их форму, развитие и полярность. Но только в растительных клетках он, во-первых, настолько структурирован, что получил название стенки, а во-вторых, отличается огромным разнообразием компонентов, у которых детерминированы разнообразные детали строения и локализации. Ключевые различия между клетками растений и животных в отношении роста, формообразования, питания, развития, репродукции и защитных механизмов связаны именно с наличием клеточной стенки.

Размеры клеточной стенки

Клеточная стенка – слой структурированного материала, расположенного снаружи от плазмалеммы. Ее толщина обычно колеблется в пределах 0,1–10 мкм (Fry, 1988, с. 2).

Клеточная стенка составляет весьма значительную часть растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет от 30 до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 80–90%. Основные компоненты растительной клеточной стенки – самые распространенные органические соединения на Земле.

Объем клеточной стенки резко отличается в различных тканях. Однако даже в растущих клетках с тонкой клеточной стенкой ее объем может составлять до 10% объема клетки, а в сформированных тканях – до 90%.

Клеточная стенка – мощный потребитель фотосинтетических ассимилятов. Именно компоненты клеточной стенки, в первую очередь целлюлозу и лигнин, которые в растительном организме практически никогда не расщепляются, можно рассматривать как конечные продукты фотосинтеза. Затраты клетки на создания клеточной стенки необходимы для образования субстратов синтеза ее компонентов, их транспортировки по растению и внутри клетки, формирования сложного ферментативного комплекса, энергетических расходов.

 

1.2 Состав клеточных стенок

Основным компонентом клеточных стенок, значение которого часто недооценивается, является вода. Матрикс клеточной стенки на 75% состоит из воды и напоминает плотный водный гель (Cosgrove, 1997). Важной характеристикой клеточной стенки является ее рН. Различные методы определения обычно дают значения рН между 4 и 5 (Fry, 1988; Peters, Felle, 1991; Rayle, Cleland, 1992; Schopfer, 1993). Однако уникальность свойств клеточной стенки определяется присутствующими в ней полимерами, среди которых полисахариды, фенольные соединения (лигнин), белки.

Номенклатура полисахаридов построена так, что последним в слове называются формирующие остов молекул моносахара, к корню которых добавляется суффикс – ан. Например, «ксилан», если остов из ксилозы, «глюкан», если остов из глюкозы и т.д. Перед названием остова ставятся названия тех моносахаров, которые встроены в боковые цепочки. Например, «глюкуроноксилан», если к остову из ксилозы присоединены боковые звенья из глюкуроновой кислоты. Правда, структура полисахаридов значительно разнообразнее, чем можно изобразить словесными построениями; с примерами этого мы столкнемся, разбирая ниже структуру отдельных полисахаридов.

Полисахариды клеточной стенки подразделяют на три класса: 1) целлюлоза; 2) связующие гликаны (раньше называли гемицеллюлозы); 3) пектиновые вещества. Эта терминология в настоящее время наиболее распространена, хотя и достаточно условна, поскольку названия основаны на разных принципах, а граница между вторым и третьим классом несколько размыта. К первому типу относится, единственный полисахарид – целлюлоза. Название второго класса полисахаридов клеточной стенки определяется тем, что они связывают между собой микрофибриллы целлюлозы. Этот термин применяют ко всем нецеллюлозным полисахаридам, не относящимся к пектиновым веществам, поэтому в этот класс попадают и те полимеры, функции которых не совсем ясны, например глюко(галакто) маннаны. Раньше все эти полисахариды называли гемицеллюлозы, что означает «полуцеллюлозы» и совсем не отражает их состав и функции. Разграничение этих полимеров с пектиновыми веществами по наличию или отсутствию уроновых кислот также не совсем абсолютно, поскольку некоторые из связующих гликанов содержат уроновые кислоты, хотя и в минорных количествах. Путаница с подобной терминологией полисахаридов клеточной стенки приводит к тому, что исследователи пытаются использовать другой тип классификации – по экстрагируемости полисахаридов различными растворами. Например, «фракция, растворимая в оксалате аммония», или «фракция, растворимая, в уксусно-азотном реактиве». Эта классификация вполне корректна, но, кроме неблагозвучности, обладает тем недостатком, что не дает представления о том, какие именно полисахариды в нее входят, поскольку у различных растительных образцов одним и тем же растворителем могут извлекаться разные полимеры. С другой стороны, один и тот же полимер может попадать в различные фракции из-за наличия или отсутствия у его молекул связей с другими компонентами клеточной стенки. Предпочтительным, конечно, является перечисление индивидуальных полисахаридов, а не несколько безликой группы полимеров, но такая характеристика является достаточно трудоемкой и выполнена лишь для ограниченного круга объектов. И все же отнесение полисахарида к той или иной группе дает его первичную характеристику и ориентиры в возможных функциях.

Целлюлоза

Целлюлоза, вероятно, – самый известный полимер клеточной стенки. Подсчитано, что ежегодно на Земле синтезируется 180 миллиардов тонн целлюлозы (Delmer, 1999). Кроме высших растений, целлюлозу способны синтезировать большинство водорослей, некоторые слизевики (Dictyostelium), ряд видов бактерий (включая цианобактерии, а также Acetobacter xylinum, Agrobacteriem tumifaciens), некоторые грибы, а среди животных организмов – оболочники (Tunicata) (Saxena, Brown, 2005).

Строение молекул целлюлозы с первого взгляда производит впечатление очень простого, поскольку они представляют собой линейные молекулы гомополимера, состоящего из глюкозы. Все остатки глюкозы находятся в пиранозной форме и соединены между собой первым атомом углерода одной молекулы глюкозы и четвертым атомои углерода следующей молекулы. Тип связи одинаков для всех мономеров – b. Все вместе это записывается как b – (1®4) – D-глюкан. Степень полимеризации молекул целлюлозы составляет порядка 10 000, колеблясь в пределах 300 – 15 000.

Цепочки целлюлозы образуют кристаллическую надмолекулярную структуру: несколько дюжин молекул целлюлозы связаны между собой водородными связями (рис. 11) и силами Ван-дер-Вальса в микрофибриллу, толщина которой составляет 5–10 нм. Отдельная молекула целлюлозы обычно имеет степень полимеризации в несколько тысяч молекул глюкозы и достигает длины 2–3 мкм. Внутри микрофибриллы молекулы целлюлозы начинаются и кончаются в разных местах, поэтому микрофибрилла может достигать сотен микрометров в длину и содержать тысячи индивидуальных цепочек. В качестве аналогии можно привести льняную нитку, которую можно сделать неограниченной длины, хотя состоит она из волокон, каждое их которых – не более нескольких сантиметров в длину. Прочность на разрыв (tensile strength) микрофибрилл целлюлозы выше, чем у стали.

В молекуле целлюлозы глюкозные остатки расположены в одной плоскости, так что формируется плоская, лентообразная цепочка. Внутри микрофибриллы отдельные молекулы расположены параллельно друг другу, то есть все восстанавливающие концы направлены в одну сторону (целлюлоза I). Подобную конфигурацию непросто объяснить с термодинамической точки зрения, поскольку при антипараллельной ориентации появляется возможность для дополнительной водородной связи, что делает такое расположение более вероятным. При самосборке целлюлозные цепи соединяются именно в антипараллельной ориентации (целлюлоза II).

В микрофибрилле высокоупорядоченные, кристаллические участки чередуются с относительно неупорядоченными, аморфными, которые отличаются по своим свойствам. Степень кристалличности (доля упорядоченных участков) в растительных объектах довольно высока и составляет от 60 до 80%. Аморфные участки – «слабое место» микрофибрилл. Различают также I_a (triclinic unit) и I_b (monoclinic unit) структуры целлюлозы I, которые отличаются молекулярной конформацией и упаковкой кристалла (Delmer, 1999). Доля I_a-типа колеблется от 64% у Valonia до 20% в волосках семян хлопчатника (Gossipium hirsutum) (Brett, 2000).

Термин «целлюлоза» (цит. по Franz, Blashek, 1990) был введен в 1838 году А. Payen и сначала использовался для обозначения целого ряда полисахаридов, поскольку не существовало способов их разделения. Аналогом этого термина в русском языке является «клетчатка». Schulze в 1891 году предложил использовать название «целлюлоза» для полисахаридов, устойчивых к разбавленной кислоте и щелочи и дающих в результате гидролиза глюкозу. Несколько позднее Nageli (с использованием поляризованного света) установил кристалличность целлюлозы, которая окончательно была доказана после появления рентгеновского анализа. Химическая природа целлюлозы как b-D – (1®4) – глюкана была установлена в 1932 году В. Хеуорсом (W.N. Haworth). Микрофибриллы целлюлозы, будучи кристаллическим образованием, расположенным снаружи от плазмалеммы, были одной из первых структур, надежно идентифицированных с помощью электронного микроскопа (Frey-Wissling et al., 1948; Preston et al., 1948).

Важно помнить, что микрофибриллы не ветвятся, они представляют из себя только «голые палки». Из них одних не удалось бы сформировать сколь-нибудь прочную объемную структуру. Сцепляют их между собой молекулы так называемых связующих гликанов.

Связующие гликаны

Остов молекул связующих гликанов устроен по тому же принципу, что и молекулы целлюлозы. Но к этому остову с определенной периодичностью добавлены боковые ответвления, которые нарушают линейность молекулы полисахарида. Другим способом получения изгибов молекулы является чередование типов связи мономеров внутри нее. В результате получается изогнутая во многих местах молекула, содержащая линейные участки. Этими линейными участками молекулы связующих гликанов взаимодействуют как с молекулами целлюлозы, так и между собой. В результате формируется прочная сеть, состоящая из двух типов молекул: целлюлозы и связующих гликанов. В роли связующих гликанов у разных организмов выступают различные полисахариды.

Ксилоглюкан. У двудольных основным связующим гликаном является ксилоглюкан. Судя по названию, ксилоглюкан – молекула, остов которой сформирован из глюкозы, а боковые цепочки – из ксилозы. Однако название очень упрощено, в нем поименованы лишь основные мономеры. На самом деле в состав боковых цепочек ксилоглюкана входят еще галактоза и фукоза, причем у разных организмов могут быть свои нюансы в составе полимера. В целом же он устроен именно по тому принципу, о котором говорилось выше. Остов молекулы построен точно так же, как молекула целлюлозы, а наличие боковых цепочек приводит к изгибам полисахарида.

Остановимся подробнее на структуре полимера, охарактеризовав на его примере способы графической характеристики полисахаридов. Остов молекулы представляет из себя b-D – (1®4) – глюкан, который ветвится путем присоединения к С-6 атомам глюкозилов остатков ксилозы. В свою очередь, остатки ксилозы могут быть соединены с остатками галактозы или арабинозы, а галактоза – с фукозой.

Расположение боковых цепочек ксилоглюкана является регулярным. Обычно в ксилоглюкане можно выделить повторяющиеся блоки, составленные из 6–11 моносахаридов, пропорции которых варьируют у различных организмов и в различных тканях. У однодольных растений, клеточная стенка которых устроена несколько иначе, чем у двудольных, функции связующих гликанов выполняют глюкан со смешанным типом связи и глюкуроноарабиноксилан.

Глюкан со смешанным типом связи. Глюкан со смешанным типом связей – линейная молекула, в которой чередуются участки, где остатки глюкозы связаны b – (1®4) – связью, как в молекуле целлюлозы, и участки, где они связаны b – (1®3) – связью. Это приводит к изгибам молекулы и делает невозможным формирования водородных связей с другими полимерами по всей длине полисахарида. b – (1®3) – связь обычно встречается через два или три остатка глюкозы, связанных b – (1®4) – связью; примерно 10% (1®4) – олигоглюкозидов могут быть более длинными.

Ксилан. Глюкуроноарабиноксилан. Ксиланы относятся к очень распространенным соединениям, часто являясь ключевыми полисахаридами матрикса вторичных клеточных стенок (например, в древесине). Остов этих молекул состоит из ксилозы – моносахара, конформационно очень схожего с глюкозой, – b-D – (1®4) – ксилан. В боковых цепочках (у С-2 или С-3) присутствует арабиноза и глюкуроновая кислота. Глюкуроновая кислота, присоединенная к ксилану, часто бывает метилированной. Доля ксилозных остатков, к которым присоединены боковые цепочки, состоящие из арабинозы и / или глюкуроновой кислоты, варьирует от 10% до 85%. Чтобы подчеркнуть высокую степень замещенности, ксилан называют глюкуроноарабиноксиланом.

Маннан. Глюкоманнан. Галактоманнан. Галактоглюкоманнан. Неразветвленный маннан – редко встречающийся полисахарид, состоящий из остатков D-маннозы, соединенных b-D – (1®4) связями. Этот полимер способен образовывать агрегаты, напоминающие микрофибриллы целлюлозы.

Глюкоманнаны являются полисахаридами, у которых остов состоит из чередующихся остатков маннозы и глюкозы. Таким образом, его название является иллюстрацией того, что для полисахаридов сложно выработать общие правила наименования (исходя из них, можно было бы предположить, что глюкоза формирует боковые цепочки). b-D – (1®4) – маннозные звенья прерываются b-D – (1®4) – глюкозными участками, доля которых составляет 25–35%.

С другой стороны, существуют сходные полимеры, в остове которых глюкоза отсутствует. В этом случае, название «галактоманнан» сформировано в полном соответствии с правилами номенклатуры полисахаридов, поскольку остов построен из маннозы, а боковые цепочки – из галактозы. Галактоманнаны – известные полисахариды клеточной стенки, присутствующие в семенах некоторых бобовых, где они играют роль запасных веществ.

Наконец, существуют галактоглюкоманнаны, остов которых устроен как глюкоманнан. При этом к некоторым остаткам маннозы присоединены боковые цепочки из одиночной a – (1®6) – галактозы (у С-6). Подобные полисахариды особенно распространенные в клеточной стенке голосеменных.

b – (1®3) – Глюкан (каллоза). Каллоза по химическому составу напоминает целлюлозу и является линейным гомополимером, состоящим из остатков глюкозы. Однако в образовани связи участвует не С-4, а С-3 атом, что приводит к совершенно иным свойствам молекулы. При классификации каллозу обычно объединяют с поперечно-связывающими гликанами, имея в виду, что ее молекула не содержит уроновых кислот, а значит, безусловно, не является пектиновым веществом. Однако правильнее, пожалуй, было бы выделить ее в особый класс полисахаридов клеточной стенки, поскольку она не участвует в образовани поперечных связей между микрофибриллами. Каллоза – своего рода «пожарный» полисахарид. Она образуется при поранении, при формировании срединной пластинки в ходе деления клетки; по-прежнему, обсуждается ее роль как промежуточного или запасного соединения.

Пектиновые вещества

Вся сеть микрофибрилл и связывающих их гликанов погружена в матрикс из пектиновых веществ. Слово «пектин» многим, наверное, знакомо в связи с мармеладом. Одна из статей в области изучения этих соединений так и называлась «Пектины – это не просто желе» (Jarvis, 1984). Пектиновые вещества – одни из самых сложных молекул биологического происхождения, которым приписывают разнообразные функции. Они были открыты в 1790 году, когда французский химик N. Vauquelin выделил из яблок вещество, образующее в водном растворе студень. Термин «пектин» (от греческого pektóV – свернувшийся) был введен в 1825 году H. Braconnot (Комиссаров, Спиридонов, 1998). Исторически сложилось деление пектиновых веществ на растворимые в воде (гидропектин) и нерастворимые – протопектин.

Непременным компонентом пектиновых веществ является галактуроновая кислота, следовательно, эти молекулы имеют заряд. Карбоксильные группы уроновых кислот могут экранироваться различными способами, например, ионами кальция или метиловыми группами, поэтому пектиновые вещества, являясь природными ионообменниками, могут создавать подвижную систему локального изменения рН, заряда и т.д. Это приводит к регулированию действия ферментов, локализованных в клеточной стенке. Кроме того, пектиновые вещества определяют пористость клеточной стенки. Обработкой клеточной стенки пектиназами (но не целлюлазами или протеиназами) можно вызвать увеличение размеров пор. Свободные карбоксильные группы уроновых кислот могут связывать Ca²⁺ и образовывать таким образом сшивки между молекулами пектиновых веществ. Считается, что пектиновые вещества являются гидрофильным наполнителем простанства между микрофибриллами целлюлозы и предотврашают их коллапс при падении тургорного давления (Jarvis, 1992).

В случае пектиновых веществ до сих пор неясно, что можно считать индивидуальным полимером. Например, существует мнение, что различные типы пектиновых веществ ковалентно связаны друг с другом (Mohnen, 1999; Vincken et al., 2003). Тем не менее, на сегодняшний день общепринята классификация их как индивидуальных компонентов клеточных стенок.

Полигалактуроновая кислота. Основным компонентом пектиновых веществ является полигалактуроновая кислота – гомополимер из остатков галактуроновой кислоты, находящихся в пиранозной форме и связанных a – (1®4) – связью. Во многом благодаря наличию полигалактуроновой кислоты, клеточная стенка имеет отрицательный заряд и ведет себя как нерастворимый полианион (Nari et al., 1991). Степень полимеризации варьирует от 30 до 200. Соли полигалактуроновой кислоты называют пектатами.

Рамногалактуронан I. Рамногалактуронан I – гетерополимер, остов которого состоит из рамнозы и галактуроновой кислоты. Соотношение Рам: ГалК часто составляет 1:1 и тогда остов состоит из повторяющегося дисахарида (®4)-a-D-ГалКр – (1®2)-a-L-Рамр (1®). В других случаях соотношение может составлять 1:2 и более. Звенья рамнозы никогда не располагаются друг за другом, всгда перемежаясь остатками галактуроновой кислоты. К 20–80% остатков рамнозы могут быть присоединены различной длины (от 1 до 50 гликозильных остатков) цепочки арабиногалактанов, арабинанов и галактанов. Ветвление полисахарида происходит только в звене рамнозы (у С-4). Типы боковых цепочек рамногалактуронана в значительной степени определяют пористость клеточной стенки, ее заряд, рН и баланс ионов. Степень полимеризации рамногалактуронана I может сильно варьировать, обычно приводятся значения около 1000.

Рамногалактуронан II. Исходя из названия полисахарида, можно было бы предположить, что остов молекулы построен как в рамногалактуронане I – из чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты, однако он устроен совсем по-другому. По разнообразию мономеров и типов связей между ними рамногалактуронан II – самый сложный их известных в живых организмах полисахаридов. Хотя степень полимеризации его всего около 60, общее число типов связей в этом небольшом полимере – 20.

Рамногалактуронан II содержит 12 различных моносахаридов, а именно галактуроновую кислоту (включая необычную, b-связанную, форму), рамнозу, арабинозу (в том числе, в необычной, пиранозной, форме), галактозу, фукозу, метилфукозу, метилксилозу, апиозу, глюкуроновую кислоту, редкую для клеточной стенки кетозу – кетодезоксиманнооктоновую кислоту, а также присутствующую только в рамногалактуронане II ацеровую кислоту (3-С-карбокси-5-дезокси-L-ксилоза) и глюкозу. Остов молекулы содержит всего 9 a – (1®4) – D-ГалКр звеньев, к С-2 и / или С-3 атомам которых присоединены боковые цепочки сложной структуры. Состав этих цепочек охарактеризован достаточно тщательно, однако порядок их расположения на остове молекулы неизвестен и указывается на схемах предположительно.

Содержание рамногалактуронана II в клеточных стенках составляет всего 0,2–3,6% от сухой массы клеточных стенок (Matsunaga et al. 2004), однако, учитывая его сравнительно небольшую молекулярную массу, число молекул этого полимера вполне сопоставимо с числом молекул самых распростаненных полисахаридов. Структура рамногалактуронана II исключительно консервативна и, несмотря на ее сложность, практически не отличается у разных организмов и в различных тканях.

Ксилогалактуронан. Апиогалактуронан. Значительно менее распространенными, чем обсуждавшиеся ранее пектиновые вещества, являются ксилогалактуронан и апиогалактуронан, которые описаны сравнительно недавно, встречаются лишь в некоторых растительных объектах и не считаются типичными. Эти полимеры родственны полигалактуроновой кислоте, которая составляет остов молекулы. Боковые цепочки состоят из одиночных остатков ксилозы или апиозы, присоединенных к С-3 галактуроновой кислоты. Частота ветвления варьирует от 25 до 75% (Schols et al., 1995).

Арабинан, галактан. В растительных клеточных стенках присутствуют цепочки a-L – (1®5) – арабинана и b-D – (1®4) – галактана. И те, и другие могут быть линейными или разветвленными, однако боковые цепочки, если присутствуют, представлены, как правило, одиночными остатками того же сахара, что и остов. Дискуссионным остается вопрос, всегда ли они являются боковыми ответвлениями рамногалактуронана I, или могут быть «самостоятельными» соединениями. Это же справедливо в отношении арабиногалактана.

Арабиногалактан. В растительных клеточных стеках обнаруживают арабиногалактан двух типов. В первом из них галактозные звенья соединены по С-4, во втором – по С-3 или С-6. Арабиногалактан II типа входит также в состав протеогликанов клеточной стенки. Антитела на арабиногалактан II типа реагируют и с арабиногалактановыми белками, и с рамногалактуронаном I, свидетельствуя, что в состав этих сложных молекул могут входить одинаковые арабиногалактановые звенья.

Прочно связанные полисахариды

Типы первичной клеточной стенки.

Типы вторичной клеточной стенки

Клеточная стенка ксиланового типа

Клеточная стенка желатинозного типа

Характеристика клеточных стенок исследуемых объектов

Клеточная стенка клеток ксилемы льна

Клеточная стенка волокон кокоса

Клеточная стенка волокон банана

 

Экспериментальная часть

 

2. Материалы и методы

 

2.1 Растительный материал

 

Лен (Linum usitatissimum) – лубоволокнистые культуры в которых формирование клеточных стенок проходит исключительно интенсивно, а стадии развития детально охарактеризованы (Горшкова и др., 2003;). Ксилема для анализа была взята ниже точки слома 5 см, растения собирали через месяц после посадки. Лен был выращен на открытом грунте. Ксилему от флоэмы отчищали вручную, старались максимально отчистить от флоэмы, поэтому этот процесс проводился дважды, а те участки, которые плохо поддавались отчистки просто отбрасывались.

Волокна банана.

Волокна кокоса.