3. Результаты и их обсуждение
При подготовке ксилемы в первую очередь надо было остановить все процессы происходящие в ней поэтому фиксировали ее. Обработка ксилемы включала два основных этапов. Первое – механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе – экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами.
Удаление пектиновых веществ с мы осуществили с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаление оксалата аммония и пектиновых веществ из нашей колбы мы центрифугируем их 3 раза с водой.
Обработка клеточной стенки ксилемы льна 4% NaOH позволяла извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония, нужен более сильный раствор. Мы применяли 4% NaOH который высвобождает целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем мы снова удаляли щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяли рН универсальной лакмусовой бумажкой, промывали до нейтрального.
Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выподает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяли в » 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждали целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА мы используем так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяли от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензировали в содержащем целлюлазу ацетатном буфере. В течение 1–2 суток фермент растворял осаждённую целлюлозу (Фильтрат 2). Мы получили раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ мы разрушаем все гликозидные связи и при высушивание весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней мы и определяем моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахоров по которым мы и опознаем конкретный моносахар.
В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.
Выводы
1. Отчистили клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.
2. Получили раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.
3. Разделили фракции по молекулярным массам.
4. Определили моносахаридный состав во фракциях.
Литература
1. Керне, А. Жизнь растений. / А. Керне // СПб.: Просвещение, – 1906. – Т. 2. – 838 с.
2. Полевой, В.В. Физиология растений. / В.В. Полевой // М.: Высшая школа, – 1989. – 464 с.
3. Brett, C.T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall / C.T. Brett // Int. Rev. Cytol. – 2000. – V. 199. – P. 61–99.
4. Chivasa, S., Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall / S. Chivasa, B.K. Ndimba, W.J. Simon, D. Robertson, X.L. Yu, J.P. Knox, P. Bolwell, A.R. Slabas // Electrophoresis. – 2002. – V. 23. – P. 1754–1765.
5. Cosgrove, D.J. Group I allergens of grass pollen as cell wall-loosening agents / D.J. Cosgrove, P.A. Bedinger, D.M. Durachko // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – V. 94. – P. 6559–6564.
6. Delmer, D. Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study / D. Delmer // Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1999. – V. 50. – P. 245–276.
7. DeWitt, G. Comparative compositional analysis of walls with two different morphologies: archetypical versus transfer-cell-like / G. DeWitt, J. Richards, D. Mohnen, A.M. Jones / Protoplasma. – 1999. – V. 209. – №3/4. – P. 238–245.
8. Frey-Wissling, A. Submicroscopic morphology of protoplasm and its derivatives. / A. Frey-Wissling. // N.Y.: Elsevier. – 1948. – 47 p.
9. Fry, S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. / S.C. Fry // London: Longman Sci. and Technic. – 1988. – 333 p.
10. Fry, S.C., Xyloglucan endotransglucosylase, a new wall-loosening enzyme activity from plants / S.C. Fry, R.C. Smith, K.F. Renwick, D.J. Martin, S.K. Hodge, K.J. Matthews // Biochem. J. – 1992. – V. 282. – P. 821–828.
11. Gaspar, T., Peroxidases 1970–1980: A survey of their biochemical and physiologic roles in higher plants. / T. Gaspar, C. Penel, T. Thorpe, H. Greppin. // Switzerland: University of Geneva Press. – 1982. – P. 60–121.
12. Gaspar, Y., The complex structures of arabinogalactan-proteins and the journey towards understanding function / Y. Gaspar, K.L. Johnson, J.A. McKenna, A. Bacic, C.J. Schultz // Plant Mol. Biol. – 2001. – V. 47. – P. 161–176.
13. Jarvis, M.C. Control of thickness of collenchyma cell walls by pectins / M.C. Jarvis // Planta. – 1992. – V. 187. – P. 218–220.
14. Jose-Estaniol, M., Plant cell wall glycoproteins and their genes / M. Jose-Estaniol, P. Puigdomenech // Plant Physiol. Biochem. – 2000. – V. 38. – №1/2. – P. 97–108.
15. Lamport, D.T.A. The protein component of primary cell walls / D.T.A. Lamport // Adv. Bot. Res. – 1965. – V. 2. – P. 151–218.
16. Lamport, D.T.A., The use of tissue cultures for the study of plant cell walls / D.T.A. Lamport, D.H. Northcote // Biochem. J. – 1960. – V. 76. – P. 52.
17. Mohnen, D. Biosynthesis of pectins and galactomannans / D. Mohnen // Comprehensive Natural Products Chemistry / Eds Pinto B.M., Barton D.H.R., Meth-Cohn O. Oxford: Elsevier. – 1999. – P. 497–527.
18. Mohnen, D. Biosynthesis of pectins and galactomannans / D. Mohnen // Comprehensive Natural Products Chemistry / Eds Pinto B.M., Barton D.H.R., Meth-Cohn O. Oxford: Elsevier. – 1999. – P. 497–527.
19. Nishitani, K., Endo-xyloglucan transferase, a novel class of glycosyltransferase that catalyzes transfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucan molecule / K. Nishitani, R. Tominaga // J. of Biol. Chem. – 1992. – V. 267. – P. 21058–21064.
20. Saxena, I.M., Cellulose biosynthesis: current views and evolving concepts / I.M. Saxena, R.M. Brown // Ann. Bot. – 2005. – V. 96. – №1. – P. 9–21.
21. Schroder, R., Mannan transglycosylase: a novel enzyme activity in cell walls of higher plants / R. Schroder, T.F. Wegrzyn, K.M. Bolitho, R.J. Redgwell // Planta. – 2004. – V. 219. – P. 590–600.
22. Schroder, R., LeMAN4 endo-beta-mannanase from ripe tomato fruit can act as a mannan transglycosylase or hydrolase / R. Schroder, T.F. Wegrzyn, N.N. Sharma, R.G. Atkinson // Planta. – 2006. – V. 224. – P. 1091–1102.
0 комментариев