2.2 Подготовка ксилемы льна к экспериментальной части

1) Фиксировали замороженную ксилему при 1000С тридцать минут.

2) Сушили 60 минут при 600С.

3) Измельчали ксилему на «мельнице».

Отчистка от непрочносвязынных пектиновых и гемицеллюлозных веществ

1)  2 гр. ксилемы заливаем 100 гр. 1% оксалата аммония.

2)  Эту колбу с смесью кипятим на водяной бане 60 минут при 970С, при этом колба закрыта.

3)  Охлаждаем колбу.

4)  Эту смесь центрифугируем 10 мин на 4000 об/мин и сливаем надосадочную жидкость.

5)  Еще раз заливаем 1% оксалатом аммония нашу смесь и кипятим на водяной бане 30 мин., также центрифугируем.

6)  Вымываем оксалат аммония водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин.

7)  Так еще три раза. Проверяем рН универсальной лакмусовой бумажкой.

8)  Готовим раствор 4Н КОН и 3% борной кислоты: 44,888 гр. КОН и 6 гр. Н3ВО3 на 200 мл. дисцилированной воды.

9)  Заливаем 100 мл раствора к ксилеме и отстаиваем 1 час, затем центрифугируем и выливаем надосадочную жидкость.

10)  Промываем водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин. промываем до тех пор пока рН среды не будет нейтральным.

 

2.3 Растворение целлюлозы

 

Получение раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде

1)  N, N-диметилацетамид (ДМА) сушили над молекулярными ситами 4А.

2)  В колбу присыпали 8 гр. хлорида лития и нагревали в термостате до 1800 в течение 4–5 часов, затем охлаждали и приливали 100 мл. высушенного над молекулярным ситом ДМА.

3)  Колбу закрывали стеклянной пробкой и раствор перемешивали на шейкере до растворения хлорида лития (оставляли на ночь).

Выделение прочно связанных полисахаридов из растворенной целлюлозы клеточной стенки ксилемы льна

1)  1 гр. «целлюлозы» суспензировали в 10 мл. воды 40–60 мин.

2)  Отделяли на воронке Шота со вставленным нейлоновым фильтром.

3)  Осадок промывали на фильтре ацетоном.

4)  Выдерживали в ацетоне (10 мл., 60 мин.)

5)  Осадок промывали на фильтре ДМА

6)  Выдерживали в ДМА (10 мл., 40–60 мин.)

7)  Оставляли на ночь в свежей порции ДМА

8)  На воронке шота отделяли «целлюлозу»

9)  Суспензировали ее в 100 мл раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде.

10) Колбу закрывали стеклянной пробкой и перемешивали до растворения целлюлозы на шейкере (1–2 дня).

11) Раствор целлюлозы по каплям добавляли к 100 мл. дисцилированной воды при перемешивание на магнитной мешалке. Раствор оставляли на ночь.

12) Отделяли выпавшую целлюлозу на воронке Шота с нейлоновым фильтром и промывали ее два – три раза дисцилированной водой (по 50 мл.) Получили Фильтрат 1

13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.

14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.

15) На роторном испарителе концентрировали раствор.

16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 1200С.

17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)

18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.

19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)

21) Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN3, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.

22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.

23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN3. 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl2 растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. Blue Dextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl2 начало 60 мл. конец 73 мл.

24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).

 


Информация о работе «Прочносвязанные полисахариды в клеточных стенках ксиланового типа»
Раздел: Химия
Количество знаков с пробелами: 41704
Количество таблиц: 1
Количество изображений: 2

0 комментариев


Наверх