Изменения в пептидергической системе онкологических больных

1.2.4 Изменения в пептидергической системе онкологических больных

Интерес к изучению протеолитических ферментов при злокачественных новообразованиях обусловлен их разнообразным влиянием на процесс канцерогенеза [13, 15]. В работе И. Л. Вовчука, А. Е. Дизика, М. Г. Ануфриева и др. было проведено сравнительное изучение протеиназной активности сыворотки крови у женщин с онкологическими заболевания эндометрия, при этом установлена обратнопропорциональная зависимость между активностью трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови и степенью дифференциации злокачественной опухоли. При гиперплазии наибольшая активность трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови наблюдается при аденоматозе, а наименьшая – при эндометриозе [15].

Наличие злокачественной опухоли в матке характеризовалось увеличением активности трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови по сравнению с показателями доноров: у женщин в возрасте от 51 до 60 лет – в 1,24 раза, у женщин в возрасте от 61 до 70 – в 2,0 раза. По сравнению с доброкачественными опухолями активность исследуемых протеиназ при наличии злокачественного процесса была выше в 1,4 раза. Следует отметить, что у больных старше 70 лет установили значительно более высокую (в 3,78 раза) протеиназную активность при наличии злокачественной опухоли. В то же время в этой возрастной группе показатели протеиназной активности как при наличии доброкачественного, так и злокачественного процесса, были в 3,3 и в 2,0 раза ниже, чем в других возрастных группах. Это можно объяснить, вероятнее всего, снижением скорости метаболических процессов, свойственных данному возрасту [31].

Снижение протеиназной активности в сыворотке крови при наличии доброкачественной опухоли и увеличение этого показателя в случае злокачественной опухоли может свидетельствовать, с одной стороны, о неспецифичности ответной реакции организма, а с другой - об отличии протеиназ тканей доброкачественной и злокачественной опухолей.

На основании полученных исследоватили предполагают, что наличие достаточно высокой активности трипсиноподобных протеиназ (выше 36,00 нмоль/мин на 1 мг белка) может свидетельствовать о плохом прогнозе заболевания и, вероятно, показания протеиназной активности свыше 100,00 нмоль/мин на 1 мг белка могут свидетельствовать об активно идущих процессах трансформации клеток, которые наблюдаются при аденоматозе (cancer in situ) [6, 15, 41].

Глава 2. Материалы и методы исследования

Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали в первый день после операции из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента.

Изучение активности ферментов было проведено у 45 мужчин в возрасте от 49 до 70 лет. Больные были оперированы по поводу опухолей легких, брюшной полости и мочеполовой системы. Они составили три экспериментальные группы. Первая группа – больные торакального отделения (18 человек); вторая – абдоминального отделения (15 мужчин); третья – урологического отделения (12 человек).

Параллельно с нашим исследованием Корниенко Е. М. проводилась работа по определению параметров гемостаза у онкологических больных данных групп, которые мы использовали в своей работе.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N

Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [62].

Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO₄, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37^oC, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37^oC и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.

Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H₂O [58].

Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.

2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [62]. Пробы колориметрировали на КФК-2 при l=590 нм. Активность АПФ определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка определяли биуретовым методом.