Метод определения содержания белка

2.2.3 Метод определения содержания белка

Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Принцип метода основан на том, что ионы меди в щелочной среде взаимодействуют с пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации общего белка.

Опытные пробы содержали 50 мкл сыворотки крови и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента (концентрат биуретового реагента развести дистиллированной водой в соотношении 1:19). Контрольные пробы содержали 50 мкл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента. В калибровочную пробу добавляли 50 мкл калибровочного раствора общего белка (раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60 г/л с добавлением хлористого натрия 9 г/л и азида натрия 1 г/л).

Содержимое пробирок тщательно перемешивали, избегая образования пены, инкубировали при комнатной температуре (+ 18 - 25С) в течение 30 минут, после чего измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм.

Концентрацию общего белка рассчитывали, как отношение оптической плотности опытной пробы к оптической плотности калибровочной пробы умноженная на концентрацию общего белка в калибровочном растворе (60 г/л).

2.3 Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [16, 29, 40]. Корреляционный анализ проводили с помощью программы «Статистика» (версия 6.0).

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

Результаты исследования показали увеличение активности КПN в сыворотке крови онкологических больных торакального и абдоминального отделения в ранний послеоперационный период по сравнению с пациентами урологического отделения (рис. 1).

Рис. 1. Активность КПN у онкологических больных в ранний послеоперационный период (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M±m, n=12¸18; достоверность отличий: ** – р < 0,01, *** – р < 0,001 относительно урологической группы).

КПN локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов. Легкие, желудочно-кишечный тракт имеют обширную капиллярную систему, после операции происходит повреждение этой системы, и вероятно, выход фермента в кровяное русло, что в итоге приводит к увеличению его активности [60].

При проведении корреляционного анализа (табл. 3), была выявлена отрицательная взаимосвязь между активностью КПN и ХЗФ у больных абдоминального отделения. В процессе свертывания крови калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген до активного кинина, который повышает чувствительность фактора XI к действию фактора XIIа [48]. Известно, что КПN участвует в деградации брадикинина [74], вероятно, увеличение активности этого фермента у данной группы больных может способствовать уменьшению свертывания крови по внутреннему пути. Кроме того, фактор Хагемана может включаться в фибринолиз, снижая время лизиса фибринового сгустка.

Обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между активностью КПN и уровнем фибриногена у пациентов урологического отделения. Фибриноген относится к острофазным белкам, концентрация которого резко возрастает в послеоперационный период, что усиливает тромбообразование на данном этапе [8]. Этот белок определяет вязкость плазмы крови, повышает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. Под действием тромбина из фибриногена образуются фибрин-мономеры, из которых впоследствии образуются фибриновый сгусток. Чрезмерное увеличение фибриногена может приводить к повышенному тромбообразованию. КПN, участвуя в инактивации брадикинина, вероятно, сдерживает активацию свертывания крови по внутреннему пути, тем самым способствуя поддержанию фибриногена на нормальном уровне у данной группы больных.

Таблица 3 Корреляционные взаимосвязи параметров гемостаза и карбоксипептидазы N

Достоверность корреляционных взаимосвязей: *– р < 0,05.

Обнаружена также положительная корреляция между активностью КПN и ХЗФ у больных урологического отделения. Известно, что в почечной ткани вырабатывается большое количество активаторов плазминогена. После оперативных вмешательств, особенно по поводу удаления опухолей, в кровь выделяется большое количество компонентов фибринолиза [44]. Вероятно, в данных условиях активность КПN может быть снижена, чтобы сдерживать антикоагуляционные процессы.