Механизм сорбции металлов микроорганизмами

1.7. Механизм сорбции металлов микроорганизмами

из растворов

Металлы влияют на многие стороны метаболизма, их действие на клетки носит, как правило, неспецифический характер. Катионы тяжелых металлов могут взаимодействовать с гидроксильными, карбоксильными, фосфатными, сульфгидрильными и аминогруппами, вызывая изменения свойств белков, нуклеотидов, коферментов, фосфолипидов, в состав которых входят перечисленные группировки. В результате ингибирования ферментных систем нарушаются дыхание, синтез белка и РНК, функции цитоплазматической мембраны.

Некоторые микроорганизмы способны приспосабливаться к высоким концентрациям ионов тяжелых металлов. Устойчивости микроорганизмов к высоким концентрациям ионов тяжелых металлов способствуют низкая проницаемость мембран для этих ионов, выведение их из клеток, а также внутриклеточное обезвреживание. Устойчивость микроорганизмов к тяжелым металлам во многих случаях детерминируется плазмидами. Выделение штаммов бактерий, устойчивых к тяжелым металлам имеет значение для современной биотехнологии.

Бактерии способны концентрировать тяжелые металлы внутри клеток или в поверхностных структурах, извлекая их из разбавленных растворов. Например, в клетках бактерий кишечной группы может накопиться до 90мг кадмия на 1г сухой биомассы [2].

Низкие концентрации тяжелых металлов могут стимулировать рост микроорганизмов [3,4]. Действительно, в ряде случаев такие тяжелые металлы, как Co, Cu, Fe, необходимы для питания микроорганизмов и должны присутствовать в питательной среде лишь в очень низких концентрациях порядка нескольких мкг/л. Любой из металлов в достаточно высоких концентрациях становится токсичным для микроорганизмов [5]. Механизмы и скорости аккумуляции металлов разные. Токсическое действие тяжелых металлов зависит от природы соединения и рассматриваемого организма. Одни элементы, такие как Cu, связываются в основном с клеточной поверхностью, где и локализуются вызываемые ими повреждения, кроме того на поверхности клеток адсорбируются кадмий, серебро, уран. Другие элементы (ртуть, цинк, никель, кобальт, свинец, стронций) проникают внутрь клетки, где связываются с определенными функциональными группами, в частности с SH-группами, инактивируя, таким образом, жизненно необходимые молекулы ферментов, или откладываются в металлической форме. Проявления токсичности могут быть различными, например, изменение морфологии клеток или клеточного метаболизма, бактериостаз или гибель клеток. Показано, что избыточное количество ионов меди в основном сорбируется на поверхности клеток. Высказано предположение, что сорбция меди на поверхности клеток затрудняет транспорт ионов через клеточные мембраны и ингибирует рост микроорганизмов [6].

Микроорганизмы по-разному реагируют на тяжелые металлы в зависимости от вида микроорганизма и концентрации тяжелых металлов в среде. Ряд микроорганизмов способен осуществлять активный транспорт некоторых из этих элементов внутрь клетки. Существуют бактерии и грибы, которые вырабатывают специальные хелатообразующие вещества, облегчающие проникновение железа в клетку при нейтральных значениях pH. Это проникновение происходит в результате активного транспорта хелатного железа и распада хелата после его переноса через мембрану. Даже токсичный ион арсената может проникнуть в клетку путем активного транспорта, как в случае Saccharomyces cerevisiae [5].

У грамотрицательных бактерий поверх однослойного или реже двухслойного муреинового мешка располагается наружный слой клеточной стенки. Этот слой стенки состоит из белков, фосфолипидов и липосахаридов.

Со слоями муреина ковалентно связаны липопротеины; они ориентированы наружу своими липофильными концами и таким образом закреплены в липофильном двойном слое (благодаря гидрофобному взаимодействию). В этом слое находятся фосфолипиды и гидрофобные концы липополисахаридов. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий выполняет не только механическую, но и важные физиологические функции. В её двойной липидный слой, состоящий из липида А, полисахаридов и фосфолипидов, встроены белки-порины, участвующие в транспорте различных веществ. Промежуток между муреином и плазматической мембраной называют периплазмическим пространством. В нём находятся белки-деполимеразы (протеиназы, рестриктазы), периферические белки плазматической мембраны и так называемые связующие белки. Последние участвуют в переносе некоторых субстратов в цитоплазму [10].

Проникая в клетку, металлы индуцируют синтез внутриплазматических соединений. В результате чего происходит связывание металла полифосфатами или белками-металлопротеинами. Молекулярная масса последних – 6.000-10.000. Для них типичны три ароматических аминокислоты и высокое содержание цистеина (30%), богатого SH-группами. Металиндуцированные протеины были обнаружены в цианобактериях, бактериях, дрожжах.

Устойчивость к металлам часто может быть связана с уменьшением поглощения или проницаемости клеточной мембраны. Транспорт ионов металлов в микробные клетки ингибируется низкими температурами, метаболитными ингибиторами и в отсутствие источников энергии. На скорость поглощения влияют метаболическое состояние клетки и состав внешней среды. Транспортные системы, встречаемые в микроорганизмах, различаются по специфичности.

Многие механизмы транспорта ионов металлов основаны на действии электрохимического протонного градиента. В некоторых случаях внутриклеточное поглощение осуществляется посредством диффузии (когда под действием токсических веществ увеличивается мембранная проницаемость). В одной из работ анализ транспорта 64Cu2 показал, что устойчивые клетки обладают пониженной аккумуляцией ионов меди в течение log фазы бактериального роста, в то время как увеличение поглощения наблюдается в стационарную фазу роста [15].

Поглощение металлов микроорганизмами идет в две стадии: первая стадия проходит в течение 2-3 минут, за это время происходит резкое снижение концентрации ионов тяжелых металлов в растворе, вторая стадия протекает значительно медленнее, так как существует зависимость этой стадии от концентрации ионов тяжелых металлов в растворе. Причиной сорбции металлов считается существование внеклеточных полимеров, а также фосфатных и уроновых групп в составе клеточной стенки микроорганизмов. Для сорбции тяжелых металлов были исследованы модифицированные материалы, содержащие различные количества привитых молекул полиакриловой кислоты и полиакрилонитов [17].

Таким образом, можно сделать вывод, что проблема изучения сорбционных свойств природных сорбентов актуальна в настоящее время. Как видно из аналитического обзора способы извлечения тяжелых металлов из разбавленных растворов до сих пор несовершенны. Исследования, посвященные совместному изучению системы «мох-микроорганизмы», вообще практически не имеют аналогов и поэтому представляют особый интерес. Из всего этого следует, что тема настоящей дипломной работы актуальна и востребована.

Однако при выращивании бактерий на жидкой среде микробная суспензия содержит большое количество взвешенных частиц питательной среды, что в дальнейшем будет вносить большую погрешность в результаты фотометрического определения концентрации микробной суспензии. В связи с этим наиболее целесообразно с точки зрения получения чистой микробной суспензии и достоверности результатов производить наращивание биомассы на твердой питательной среде и затем отделять ее от питательного агара путем смыва культуры небольшим количеством физиологического раствора.

После того, как сорбенты (микроорганизмы и/или мох) обрабатываются растворами тяжелых металлов необходимо отделение самих сорбентов от раствора тяжелых металлов. Для отделения мха использовался бумажный фильтр. Для отделения микроорганизмов применялось центрифугирование на скорости 8000 об/мин в течение 10 минут.

При изучении сорбционной способности системы «мох-микроорганизмы» для отделения растворов металлов от сорбентов наиболее целесообразно применение микробного фильтра. Этот процесс длителен, поэтому при изучении кинетики сорбции металлов системой «мох - микроорганизмы» надо это учитывать, для того чтобы не вносить большую погрешность в измерения.

Определение ионов тяжелых металлов в растворах возможно фотоколориметрическим, фотометрическим и титриметрическим методами. В случае первых двух методов требуется перевод ионов металлов в комплексы. Эти методы трудоемки, сложны в исполнении и требуют значительных навыков исполнения.

Титриметрический метод в отличии от двух вышеперечисленных методов определения ионов тяжелых металлов прост и удобен в применении, а также имеет высокую точность определения. Он позволяет быстро и качественно провести определение ионов исследуемых металлов. Ионы металлов оттитровываются раствором ЭДТА в присутствии металлоиндикаторов (мурексид, эриохромовый черный Т).