Запишите результаты определений глюкозы в крови

1. Запишите результаты определений глюкозы в крови.

2. Зарисуйте схемы устройства ферментного электрода и автоматического анализатора.

Работа 16. Определение мочевины в крови человека с использованием ферментных реагентов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматическая пипетка с наконечниками, биохимический анализатор Рефлотрон +.

*Забор крови осуществляется в капилляр, как описано в работе № 14.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

Биохимический анализатор Рефлотрон предназначен для экспресс-анализа образцов свежей крови и сыворотки человека. Прибор не требует для работы никаких реактивов, кроме тест-полосок для однократного определения исследуемых веществ. Тест-полоска для определения мочевины содержит лиофилизированный фермент уреазу и индикатор в лейко-форме. Образец нагревают, и мочевина, содержащаяся в образце, при 37۫°С расщепляется с образованием аммиака и оксида углерода. Это ведет к частичной смене окраски индикатором на зелено-голубую, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству мочевины в пробе:

(NH₂)₂CO + H₂O = 2 NH₃ + CO₂

NH₃ + индикатор (бесцветный) = NH₄⁺ + индикатор (сине-зеленый).

После 3 минут, необходимых для инкубации образца, измеряется оптическая плотность по принципу рефлексионной фотометрии. На тест-полоске имеется магнитная лента с информацией об анализе. Прибор считывает информацию об анализе и пересчитывает оптическую плотность в концентрацию.

Приготовьте тест-полоску для анализа. Удалите с ее поверхности защитную алюминиевую полоску. Дозатором отмерьте 32 мкл образца и нанесите его в центр зоны аппликации, не касаясь наконечником тест-полоски. Откройте крышку прибора и поместите тест-полоску в анализируемую зону. Закройте крышку. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений мочевины в крови.

Работа 17. Иммуноферментное определение тестостерона в сыворотке крови

Оборудование и реактивы: сыворотка крови человека, автоматическая пипетка с наконечниками, набор стандартных растворов тестостерона с известными концентрациями, иммуноферментный коньюгат, субстратный раствор, стоп-раствор, стрипы с иммобилизованными моноклональными антителами к тестостерону, инкубатор для планшет, вошер для планшет, иммуноферментный ридер планшет.

Тест-система ИФА для определения тестостерона основана на принципе конкурентного связывания. Лунки микротитра покрыты антителом к уникальному антигенному сайту на молекуле тестостерона. Эндогенный тестостерон в пробе конкурирует с конъюгатом тестостерона и пероксидазы хрена за связывание с антителом, которое сорбировано на микропанелях. После инкубации несвязавшийся конъюгат смывается. Количество связавшегося конъюгата обратно пропорционально концентрации тестостерона в образце. При добавлении субстратного раствора интенсивность полученного окрашивания обратно пропорциональна концентрации тестостерона в сыворотке.

Общие замечания к проведению анализа

− Все пробы и реагенты перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры. Смешивание реагентов надо осуществлять, избегая вспенивания.

− После начала проведения теста следует осуществлять все этапы последовательно без прерывания.

− Для каждого реагента используйте новые чистые пластиковые наконечники микропипеток для исключения перекрестной контаминации. Для раскапывания субстрата и останавливающего раствора не следует использовать пипетки с металлическими частями.

− Вносите стандарты и пробы в нижнюю часть лунки с помощью микропипетки. Что касается внесения Иммуноферментного Конъюгата и Стоп-раствора, рекомендуется держать пипетку вертикально и направлять падающую каплю строго в центр лунки для осуществления полного перемешивания указанных компонентов.

− Перед постановкой теста рекомендуется подготовить все реагенты, снять крышки, закрепить в держателе необходимое количество полосок с лунками. Это обеспечит равные затраты времени на все необходимые этапы ИФА и предотвратит задержки пипетирования.

− В целом ферментативная реакция обычно линейно пропорциональна времени проведения и температуре. Это делает возможной интерполяцию для физико-химических условий реакции. В частности, если величина абсорбции нулевого стандарта ниже 1,0 или же превышает верхний уровень возможного измерения для используемого ридера, можно изменить время инкубации с субстратом до 30 мин, или же до 10 мин, соответственно этим наблюдениям.

− Поскольку калибрующие стандарты проставляются в каждом тесте, флюктуации абсолютных величин абсорбции не отражаются на конечном результате ИФА.

− Раствор субстрата перед использованием должен быть бесцветным или иметь чуть различимый голубовато-зеленоватый оттенок. Наличие выраженного голубого окрашивания указывает на непригодность субстрата. Его следует заменить!

− Во время инкубации с Субстратом следует защитить микротитровальные панели от света.

ЗАБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛИЗА

1. Для исследования надо использовать сыворотки, или же плазму после обработки EDTA. Не требуется какой-либо дополнительной подготовки проб. Пробы для анализа можно хранить при 2 – 8 °С до 5 дней, при необходимости более длительного хранения пробы необходимо замораживать и хранить при – 20 °С или более низкой температуре. Не используйте пробы с выраженным гемолизом или с повышенным содержанием липидов.

2. Пробы, содержание тестостерона в которых предположительно превышает 16 нг/мл, следует разводить с использованием нулевого стандарта.

3. Если при первой постановке образец сыворотки показал концентрацию больше, чем высший стандарт, то образец должен быть разведен в 10 или в 100 раз нулевым стандартом и проанализирован снова. При подсчете должен приниматься во внимание фактор пересчета.

ВНИМАНИЕ! В данном тесте нельзя использовать пробы, содержащие азид натрия.

1. Закрепите желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе.

2. Внесите по 25 мкл стандартов тестостерона и проб в соответствующие лунки.

3. Внесите 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку.

4. В течение 10 сек. смешивайте реагенты в панели. На этом этапе чрезвычайно важно добиться полного смешивания реагентов.

5. Не закрывая панель, инкубируйте при комнатной температуре 60 мин.

6. Освободите лунки от содержимого (например выплеснув и постучав по фильтровальной бумаге). Трижды промойте лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку). Тщательно “выбейте” остатки жидкости на фильтровальной бумаге. Операцию № 6 рекомендуется осуществлять в автоматическом режиме, используя автоматический вошер для планшет.

7. Внесите 200 мкл энзим-субстрата в каждую лунку с равными временными интервалами.

8. Инкубация 15 мин при комнатной температуре.

9. Остановите реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора с такими же временными интервалами, как на этапе 7.

10. Измерьте оптическую плотность в лунках при длине волны 450 + 10 нм в течение 10 мин после добавления стоп-раствора

Содержание отчета

1. Определите значение абсорбции для стандартов и образцов.

2. Используя любую миллиметровую или логарифмическую сетчатую бумагу, постройте стандартную кривую, нанося значения абсорбции (Y) Стандартов против их концентрации (Х) в нг/мл.

3. Используйте среднюю величину абсорбции каждой пробы для интерполяции концентрации Тестостерона путем простого наложения данных на указанную кривую.

Запишите концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Работы № 11 – № 14 выполняются каждая в течении одного дня, так как ферменты-маркеры субклеточных фракций инактивируются при замораживании-оттаивании. В случае нехватки времени на выполнение полной схемы работы выполняются в следующем варианте:

- активность ферментов-маркеров определяется в свежеприготовленном 1% гомогенате. 100 мг печени гомогенизируется в 1,9 мл рабочего буфера (в работе № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; в работе № 12 - 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; в работе № 13 - буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; в работе № 14 - 0,1 М цитратный буфер рН 6,5). Затем гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок.

2. Определение белка по Лоури. Необходимые реактивы: реактив Фолина, реактив А, реактив В.

Реактив А. 0,5 г CuSO₄·5H₂O + 1 г цитрата Na на 100 мл воды, хранить в морозильнике. Для использования разморозить небольшую часть и хранить в холодильнике.

Реактив В. 4 г NaOH + 54 г Na₂CO₃·10H₂O (или 20 г Na₂CO₃) на литр воды.

Реактив С. 50 мл В + 1 мл А. Готовить непосредственно перед определением концентрации белка.

Для определения концентрации в три пробирки наливают по 0,5 мл разведенного раствора белка, в каждую из трех пробирок и в контроль (0,5 мл дист. воды) приливают по 1 мл реактива С, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем приливают по 0,1 мл реактива Фолина и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Можно больше. Все пипетки сразу промыть дистиллированной водой. Измеряют светопоглощение на ФЭК при λ=750 нм в кювете толщиной 1 см против контроля.

Библиографический список

1. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. – 332 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - Т. 1 – 3.

3. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир,

1980. – 432 с.

4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.

5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высш. школа, 1980. – 272 с.

6. Практикум по биохимии/ под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой.

– М.: МГУ, 1989. – 509 с.

7. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978. – 248 с.

8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир,

1979. – 280 с.

9. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. – М.: Мир, 1983. – 293 с.

10. Бернхард С. Структура и функция ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с.

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. Г. БЕЛИНСКОГО

В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин

Практикум по энзимологии

Учебно-методическое пособие

Редактор – Л. И. Дорошина

Корректор – Е. С. Моисеева

Оригинал-макет – В. Б. Соловьев

Поз. 157

Подписано к печати 07.12.07 Формат 60 × 84 / 16

Бумага писчая белая Печать офсетная

Усл. – печ. л. 3,0 Уч. – изд. л. 3,2

Тираж экз. 100 Заказ № 175 / 07 Цена С. 183

Редакционно-издательский отдел ПГПУ им. В. Г. Белинского:

440026, Пенза, ул. Лермонтова, 37,

Педагогический университет, корпус 5, комната 466

Отпечатано с готового оригинал-макета в мини-типографии

ООО КФ «Партнер-ДелКон»:

г. Пенза, ул. Богданова, 2а,

тел. 52-58-60, 52-58-61

E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru