Рассчитайте активность фермента

2. Рассчитайте активность фермента.

3. Напишите рекомендуемое систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

Работа 3. Флюориметрическое определение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы

Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ*, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR)**, 1 н HCl, хлороформ, печень животного, реактив Фолина, реактивы А и В для метода Лоури.

* Приготовление раствора ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ растворяют в 5 мл дважды перегнанного этилового спирта.

** Приготовление раствора DNS-FLR: К 1 мг DNS-FLR дозатором прибавляют 50 мкл метанола, а затем – 7,5 мл натрий-ацетатного буфера рН=5,6.

200 мг печени гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат хранят на льду. Пробирки каждой параллели (3 опытных и 3 контрольных) помещают, предварительно подписав, в один штатив. Раскапывают реактивы по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течении 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λ_ех=360 нм, λ_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури (см. примечание 1) Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =  

Содержание отчета

1. Рассчитайте активность фермента в исследуемом материале.

2. Опишите фермент и его предполагаемую биологическую роль. Напишите предполагаемый систематический код фермента.

Работа 4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза трипсином бензоил-аргинин-пара-нитроанилида методами Лайнуйвера-Бэрка и Эйзенталя-Корниш-Боудена. Определение типа ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, растворы БАПНА следующих концентраций: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, раствор трипсина (10 мкг/мл), раствор ингибитора трипсина* (10 мкг/мл), 1 н HCl.

* Приготовление раствора ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Рабочий раствор готовят непосредственно перед опытом путем стократного разведения исходного раствора дистиллированной водой.

Для определения V_max и К_м данной реакции, а также типа ингибирования трипсина строят график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора (в системах координат Лайнуйвера-Берка и Эйзенталя-Корниш-Боудена). Для каждой концентрации субстрата выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.

Активность фермента в присутствии ингибитора определяют по схеме.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости строят на миллиметровой бумаге.

Содержание отчета

1. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Лайнуйвера-Бэрка.

2. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Эйзенталя и Корниш-Боудена.

Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.

1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами БАПНА с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.

2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:

а) при комнатной температуре;

б) при 4 °С (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);

в) на водяной бане при t=55 °С;

г) на водяной бане при t=75 °С.

Содержание отчета