Определите степень очистки ФМСФ-КП

1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.

Работа 9. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на карбоксиметилцеллюлозе)

Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,5 и 6,0; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.

Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию КМЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию КМЦ прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5.

2 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.

Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.

Затем фермент элюируют 0,05 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 6,0. С момента нанесения этого буфера на колонку собирают 10 фракций объемом 3 мл.

Во 2, 3, 4, 5, 6, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λ_ех=360 нм, λ_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =  

Содержание отчета