1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С |
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. |
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | | | | | | | | | | | | |
| Аоп – Акн | | | | | | |
| Количество тирозина по калибровочной кривой | | | | | | |
| Активность на 1 мг ткани | | | | | | |
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | | | | | |
| Количество белка на 1 мг ткани | | | | | | |
| Белок в % от белка гомогената | 100% | | | | | |
| Относительная удельная активность фракций | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | |
Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С |
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С |
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
| Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С |
| 1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl |
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
Содержание отчета
Раздел:
Медицина, здоровье Количество знаков с пробелами: 52671
Количество таблиц: 30
Количество изображений: 1
... ферменты. – М.: Мир, 1983. – 293 с. 4. Бернхард С. Структура и функция ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с. Требования к уровню освоения программы В результате изучения данной дисциплины студент должен знать классификацию и номенклатуру ферментов, их строение и механизмы функционирования, а также современные методы работы с ферментами. уметь применять приемы номенклатуры ферментов, ...
... составлена в соответствии с Государственным образовательным стандартом Высшего профессионального образования для студентов, обучающихся по специальности 020208 – «Биохимия». 4. Место дисциплины в профессиональной подготовке студентов Курс «Энзимология» предшествует изучению студентов курсов кинетики и термодинамики ферментативных реакций. Он имеет основополагающее значение, поскольку главным ...
... является курсом, для изучения которого необходимо наличие знаний об основных принципах организации биологических молекул, строении и механизмах действия ферментов. Дисциплина биохимия мембран относится к дисциплинам специализации федерального компонента. 5. Распределение времени, отведенного на изучение дисциплины по учебному плану Форма учебной работы Форма обучения Очная По ...
... живых организмов, биологических процессов и систем в производстве, включая превращение различных видов сырья в продукты. По определению академика Ю.А. Овчинникова, биотехнология - комплексная, многопрофильная область научно - технического прогресса, включающая разнообразный микро - биологический синтез, генетическую и клеточную инженерную энзимологию, использование знаний, условий и ...
0 комментариев