1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С |
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. |
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | | | | | | | | | | | | |
| Аоп – Акн | | | | | | |
| Количество сукцината | | | | | | |
| Активность на 1 мг ткани | | | | | | |
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | | | | | |
| Количество белка на 1 мг ткани | | | | | | |
| Белок в % от белка гомогената | 100% | | | | | |
| Относительная удельная активность фракций | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | |
Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10-5 М)***.
* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.
** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na2SO3 приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН2РО4 растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.
**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 |
| 100 мкл фракции | 100 мкл фракции | 100 мкл буфера |
| Инкубация 10 мин при 37°С | – | – |
| 100 мкл Г-6-Ф | 100 мкл буфера | 100 мкл Г-6-Ф |
| Инкубация 20 мин при 37°С |
| 2 мл 10 % ТХУ |
Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 | стандарт |
| 1 мл надосадочной жидкости | 1 мл станд. р-ра фосфора |
| 5 мл раствора молибдата |
Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.
Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.
Содержание отчета
Раздел:
Медицина, здоровье Количество знаков с пробелами: 52671
Количество таблиц: 30
Количество изображений: 1
... ферменты. – М.: Мир, 1983. – 293 с. 4. Бернхард С. Структура и функция ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с. Требования к уровню освоения программы В результате изучения данной дисциплины студент должен знать классификацию и номенклатуру ферментов, их строение и механизмы функционирования, а также современные методы работы с ферментами. уметь применять приемы номенклатуры ферментов, ...
... составлена в соответствии с Государственным образовательным стандартом Высшего профессионального образования для студентов, обучающихся по специальности 020208 – «Биохимия». 4. Место дисциплины в профессиональной подготовке студентов Курс «Энзимология» предшествует изучению студентов курсов кинетики и термодинамики ферментативных реакций. Он имеет основополагающее значение, поскольку главным ...
... является курсом, для изучения которого необходимо наличие знаний об основных принципах организации биологических молекул, строении и механизмах действия ферментов. Дисциплина биохимия мембран относится к дисциплинам специализации федерального компонента. 5. Распределение времени, отведенного на изучение дисциплины по учебному плану Форма учебной работы Форма обучения Очная По ...
... живых организмов, биологических процессов и систем в производстве, включая превращение различных видов сырья в продукты. По определению академика Ю.А. Овчинникова, биотехнология - комплексная, многопрофильная область научно - технического прогресса, включающая разнообразный микро - биологический синтез, генетическую и клеточную инженерную энзимологию, использование знаний, условий и ...
0 комментариев