Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

Сметанин Владимир Анатольевич

ВЛИЯНИЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА

 

03.00.04 – Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М.Т.

ПЕНЗА 2004

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………............5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………..........10 1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен………………………….10 1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла………………………………………………………………..12 1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла…………………………………………………………………………......12 1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………………………………...17 1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы…………………….21 1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме…..................21 1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов………………………………………………………….….……29

1.4. Карбоксипептидаза Н………………………………………………...........32

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза…………………………..……35

1.6. Карбоксипептидаза М…………………………………………….…...........37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………..…39

2.1. Материалы исследования…………………………………………..............39

Методы исследования……………………………………………………………......40

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М……………………………………………………............40

2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы…………………………………………………………..…..41

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования………………….…42

2.3. Схема эксперимента………………………………………………………....43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………........44 3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА………………………………………….44 3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………............44 а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самок крыс…………………………………………………………………..……44  б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………………………………..45  в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс………………………………………...48 3.1.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………..59 а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самок крыс………………………………………………………………………………59 б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок ………………………………….60 в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………………………62 3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………….……74 а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс………………………………………………………………………………74 б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………….…………………..75 в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………….76 3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМЦОВ КРЫС …………………….81 3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс…81 а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс………………………………………………………………………81  б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….82  в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………….84 3.2.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс……………..91 а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самцов крыс……………………………………………………………………………….91 б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….92 в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…………………………………………………..94 3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс……………100 а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс……………………………………………………………………………...100 б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…………….…………………..100 в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………...101 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..105 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….133 ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………….........135
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ – адренокортикотропный гормон

АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система

ГГНГС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система

ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГРФ – гонадотропин-рилизинг-фактор

ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота

ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

ДСИП – дельта-сон-индуцирующий пептид

КПА – карбоксипептидаза А

КПВ – карбоксипептидаза В

КПН – карбоксипептидаза Н

КПM – карбоксипептидаза M

КПN – карбоксипептидаза N

ЛГ – лютеинизирующий гормон

ЛКПА – лизосомальная карбоксипептидаза А

ЛКПВ – лизосомальная карбоксипептидаза В

ПОМК – проопиомеланокортин

ПХМБ – п-хлормеркурийбензоат

ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат

ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид

ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая

карбоксипептидаза

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Проблема алкоголизма, особенно женского, является крайне актуальной для человечества, как с социальной, так и с медицинской точки зрения. Клинические наблюдения указывают на то, что под действием этанола в организме женщины возникают существенные изменения в эндокринной системе, что сопровождается нарушениями половой функции [2, 81].

При алкоголизме существенно меняется уровень целого ряда нейропептидов, многие из которых играют существенную роль в этиологии и патогенезе данного заболевания [19, 61, 74, 88]. Изменение уровня биологически активных пептидов при алкогольной интоксикации во многом определяется ферментами их обмена, к которым, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая кар-боксипептидаза и карбоксипептидаза М – основные карбоксипептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов [28, 41, 144, 212].

Интерес к этим ферментам вызван тем, что они участвуют в процессинге, модуляции и инактивации биологически активных пептидов [28, 41, 144]. В связи с тем, что нейропептиды выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов, они участвуют в регуляции практически всех функций организма, в том числе и в регуляции функционирования полового цикла [11, 72], а также вовлекаются в развитие многих патологических состояний, среди которых для современной биологии и медицины особую значимость представляет алкоголизм [19, 74, 88]. Прогресс в изучении природы этого заболевания неотделим от понимания нейробиологических процессов, лежащих в его основе [80]. В этой связи представляется очень важным исследование активности основных карбоксипептидаз при острой алкогольной интоксикации. Чем глубже будут наши представления об энзимопатологии, о роли протеолитических ферментов в гомеостазе, тем более целенаправленным будет поиск лекарственных средств для лечения алкоголизма среди регуляторов активности ферментов.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме женских особей при алкогольной интоксикации. Однако при этом необходим учет особенностей женского организма, связанных с наличием полового цикла, который сопровождается комплексом физиологических, биохимических и других изменений, происходящих во всем организме. В ходе эстрального цикла наблюдаются значительные изменения в функционировании пептидэргических систем [11], что, несомненно, связано с изменением активности ферментов участвующих в обмене биологически активных пептидов [28, 41] и в свою очередь, вероятно, определяет особенности ответной реакции женского организма на острую алкогольную интоксикацию на разных стадиях эстрального цикла [101, 164].

Кроме того, известно, что некоторые аспекты проявления острой алкогольной интоксикации определяются в значительной степени полом. Предполагают, что это связано с различиями в гормональном статусе самцов и самок [44]. Различный уровень нейропептидов, определяемый активностью ферментов их обмена, у особей разного пола приводит к появлению отличий в количестве потребляемого этанола, в скорости развития зависимости, а также появлению различий в течение алкогольной интоксикации у особей противоположного пола [5, 19, 64, 65].

Изучение активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов при острой алкогольной интоксикации может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению механизмов функционирования пептидэргических систем при данном патологическом состоянии.

Целью нашей работы было изучение активности основных карбоксипептидаз (карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М) в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при острой алкогольной интоксикации.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1.  Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз на разных стадиях эстрального цикла в тканях интактных самок крыс.

2.  Исследовать активность карбоксипептидазы Н, фенилметил-сульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбокси-пептидазы М у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при введении этанола через различные промежутки времени.

3.  Сравнить активность исследуемых ферментов у самцов и самок при острой алкогольной интоксикации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние острой алкогольной интоксикации на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла. Для определения половых отличий в течении и развитии алкогольной интоксикации исследована активность этих ферментов в тканях самцов крыс. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от стадии эстрального цикла, пола, дозы этанола и времени после его введения. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и проясняют роль основных карбоксипептидаз в норме, а также при алкогольной интоксикации и могут быть использованы для разработки эффективных методов профилактики и лечения алкоголизма, нарушений полового цикла и бесплодия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях Российской Академии Естествознания (Россия, Дагомыс, октябрь 2003 г. и Египет, Хургада, февраль 2004 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2002, 2003 гг.). По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 6 рисунками, 21 таблицей и 2 схемами. Список литературы содержит 268 наименований на русском и иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен.

 

Важное место в химической передаче информации занимают нейропептиды [72]. Многие из нейропептидов выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов, гормонов, факторов роста [9, 51, 77, 139, 164].

Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции полового цикла, деятельности иммунной системы, в морфогенезе, участвуют в формировании поведенческих реакций, в процессах обучения, механизмах консолидации памяти, влияют на половую дифференциацию [8, 11, 60, 70, 72, 210], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических расстройств, в том числе и алкоголизма. Так, например, у особей исходно склонных к развитию алкоголизма, выявлен центральный (тотальный или региональный) дефицит нейропептидов, функция которых связана с активацией системы положительного подкрепления (с эйфоризирующим, антистрессорным, анксиолитическим действием). Одновременно отмечается увеличение содержания нейропептидов, активирующих систему негативного подкрепления (проконвульсанты, пептиды, индуцирующие страх, агрессию, дисфорию). Как правило, однократное введение этанола, особенно в низких, анксиолитических дозах, нивелирует эти диспропорции, с чем, очевидно, и связано развитие влечения к этанолу, особенно у предрасположенных к алкоголизму индивидуумов[15, 19, 62, 80].

По современным представлениям функционирование конкретного регуляторного пептида связывается с местом его образования, высвобождения и наличия соответствующих рецепторов [52, 53, 54, 69]. Таким образом, для понимания механизмов действия нейропептидов существенным моментом является изучение их образования и деградации.

Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников – препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа [75, 114, 181, 256]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР [156, 256]. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР. Внутри ЭПР сигнальная последовательность отщепляется от полипептидной цепи сигнальной пептидазой. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [29, 256].

Сначала под действием эндопептидаз, расщепляющих нейропептиды по синглетным и дуплетным остаткам основных аминокислот, (фурин, РС1/3, РС2, РС4 [242], проопиомеланокортин-превращающий фермент [193, 194], тиоловая прогормонконвертаза [96, 97], динорфин-превращающий фермент [129] и др.) образуются неактивные пептиды [1, 29, 72], содержащие, как правило, “лишние” N- или, в основном, С-концевые остатки аминокислот. Удаление этих аминокислот в секреторных везикулах осуществляется соответственно аминопептидазо-В-подобным(и) [41, 156] и карбоксипептидазо-В-подобным(и) ферментами [27, 29, 41, 144, 145].

Таким образом, уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена.

Основным карбоксипептидазам как ферментам, участвующим в конечных стадиях образования и начальных стадиях деградации, принадлежит важная роль в регуляции уровня нейропептидов в организме. В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности основных карбоксипептидаз в норме и при различных физиологических и патологических состояниях организма, сопровождающихся изменением содержания биологически активных пептидов.