Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов

Под влиянием этанола отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации нейропептидов [26, 31, 36]. Последние в свою очередь напрямую или опосредованно могут влиять на предпочтение к этанолу, развитие толерантности, а также вовлекаются в ответную реакцию организма на алкогольную интоксикацию. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при алкогольной интоксикации.

Mayas и соавт. изучено влияние этанола на активность аминопептидаз синаптосом головного мозга мышей in vitro. Под действием этилового спирта дозозависимо ингибировалась аланинаминопептидаза; активность аргинин-, цистеин-, лейцин-, тирозинаминопептидазы под действием малых доз этанола увеличивалась, большие дозы оказывали противоположный эффект. Инкубация синаптосом в среде 25 мМ К⁺ в присутствии этанола приводит к ингибированию всех исследованных аминопептидаз [205].

При хронической алкогольной интоксикации содержание мРНК АПФ и нейтральной эндопептидазы заметно уменьшается в мозге мышей [265]. Имеются данные о том, что активность нейтральной эндопептидазы в сыворотке крови людей коррелирует с количеством потребляемого алкоголя [142], выявлено увеличение активности ренина в плазме крови у лиц в состоянии алкогольного опьянения [63]. Активность катепсина А и D у людей с острой алкогольной интоксикацией не изменялась по сравнению с контролем, в то время как она увеличивалась в сыворотке у хронических алкоголиков [178].

Хроническое потребление этанола самцами крыс приводит к снижению активности АПФ в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме, что может способствовать повышению уровня опиоидных и стресс-пептидов [31]. Острая алкогольная интоксикация ведет к изменению активности КПN в сыворотке крови крыс, причем эти изменения зависят от дозы вводимого этанола. При остром и хроническом потреблении этанола животными наблюдается достоверное повышение активности энкефалиназы А в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге. Авторами работы высказывается предположение, что нарушения деградации энкефалинов играют ключевую роль в реализации действия этанола на энкефалинэргическую систему мозга [76].

Через 6 часов после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1г/кг происходило повышение активности КПН в гипофизе, гипоталамусе, среднем мозге и стриатуме. В сером веществе и гиппокампе активность фермента не изменялась. Введение этанола в дозе 4 г/кг вызывало повышение активности фермента в гипофизе, гипоталамусе и сером веществе; в среднем мозге и стриатуме активность не изменялась [26]. В другой работе указывается, что у самцов крыс, которым вводили внутрибрюшинно этанол в дозе 4 г/кг через 3 и 6 часов после его введения отмечено повышение удельной активности энкефалинконвертазы в коре мозга и среднем мозге; в гиппокампе изменения активности фермента носили синусоидальный характер [14]. Хроническое потребление этанола вызывало снижение активности КПН в гипофизе [25, 26], гипоталамусе [26], стриатуме [26, 36], коре мозга и среднем мозге [14]. Во всех исследованных отделах активность мембраносвязанной формы изменялась более значительно, чем растворимой, что, вероятно, связано с мембранотропным эффектом этанола [256].

Достоверные изменения активности КПМ при хроническом потреблении этанола выявлены в гиппокампе, где активность КПМ увеличивается, но снижается в больших полушариях, не обнаружено достоверных отличий в активности фермента в гипоталамусе, стриатуме и четверохолмии [36]. Хроническая алкоголизация существенно влияла на активность ФМСФ-КП: активность фермента повышалась в гипоталамусе, стриатуме, четверохолмии, то есть тех отделах головного мозга, в которых при алкоголизации наблюдаются наиболее существенные изменения уровня энкефалинов и некоторых других нейропептидов. Активность ФМСФ-КП при хронической алкогольной интоксикации осталась на прежнем уровне в гиппокампе и больших полушариях [36].

Интересные данные о влиянии внутрибрюшинного введения самцам крыс физиологического раствора на активность ферментов обмена нейропептидов приводятся в работе Вернигоры и соавт. [38]. Ими обнаружено повышение активности КПН в гипофизе и стриатуме, АПФ в гипофизе и сыворотке крови, КПN в сыворотке. Эти ферменты участвуют в обмене целого ряда НП, поэтому внутрибрюшинное введение физраствора может приводить к значительным изменениям в функционировании пептидэргических систем. Причем эти изменения затрагивают стресс-систему, опиоидэргическую и ангиотензин-брадикининовую систему. Поэтому при проведении острых экспериментов необходимо рассматривать все наблюдаемые явления с учетом изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией [38]. В ряде работ указывается, что, по-видимому, КПН, КПN и АПФ вовлекаются в реализацию стресс-протективного действия этанола [26, 40].

Таким образом, этанол вызывает изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, что можно рассматривать как один из патогенетических факторов алкоголизма.

КПH (КПE, энкефалинконвертаза) впервые выделена и охарактеризована Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [152]. Позднее фермент был выделен и очищен из мозга [34, 153, 154], гипофиза [153, 154], островков Лангерганса поджелудочной железы [122, 133, 161, 198]. Фермент, выделенный из разных тканей разных видов животных, имеет очень близкие физико-химические и каталитические свойства.

КПH является одноцепочечным гликопротеином и существует как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах [34, 122, 197]. Существуют две формы мембраносвязанной КПH, отличающиеся по прочности связывания с мембранами. Одна из этих форм экстрагируется из мембран при pH 5,6 1 M раствором NaCl, вторая – только при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X-100 [147, 258].

Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000 [209], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [140, 161]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [168, 169], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Отличия в Mr этих форм не связаны с различиями в степени гликозилирования [161, 220, 221]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [220]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [161, 140]. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [143, 147]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [171]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [147]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. В аминокислотной последовательности КПH обнаружен также Ca²⁺-связывающий участок [213], но ионы Ca²⁺ влияют не на активность, а на стабильность, агрегацию и способность к связыванию с мембранами [255].

КПН проявляет максимальную активность при рН 5,5-6,0, что соответствует рН внутри секреторных везикул и является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится ион Zn²⁺ [149, 153]. Данный фермент сильно (примерно в 5-10 раз) активируется ионами Со²⁺, в меньшей степени (в 2-3 раза) – ионами Ni²⁺, ингибируется ионами Сd²⁺ и Cu²⁺, хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn²⁺. Фермент также ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с К_i 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

ФМСФ, 2-меркаптоэтанол, а также ионы Мg²⁺ и Mn²⁺ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258].

КПH отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца синтетических и природных пептидов. Скорость отщепления остатков аргинина в несколько раз больше, чем остатков лизина. Остатки гистидина отщепляются с очень маленькой скоростью, по сравнению с остатками лизина. Остатки ароматических аминокислот не отщепляются. Скорость расщепления субстратов зависит от предшествующего аминокислотного остатка. Скорость расщепления дансил-фен-ала-арг на порядок выше, чем скорость расщепления дансил-фен-гли-арг, дансил-фен-лей-арг и дансил-фен-иле-арг [167, 172, 234, 254].

Локализация фермента в целом соответствует распределению биологически активных пептидов и их предшественников [50, 144, 145]. Наиболее высокая активность КПH обнаружена в аденогипофизе, хромаффинных гранулах надпочечников [152, 153, 154] и островках Лангерганса поджелудочной железы [122, 161]. Более низкая (примерно на порядок) активность фермента обнаруживается в задней доле гипофиза [172, 177], гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [89]. Наиболее низкая активность КПH обнаружена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках. Установлено, что КПH ассоциирована со структурными элементами ЭПР, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [144]. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины [196], атриальный натрийуретический фактор [197], глюкагон [161, 218], инсулин [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], вещество P [111], вазопрессин и окситоцин [214, 234] и другие регуляторные пептиды. Различные ингибиторы и активаторы секреции координировано регулируют выделение КПH и энкефалинов [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактина [150], вазопрессина [103, 200] и инсулина [160].

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПН свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, b-эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р и др.

Показано, что КПН вовлекается в определение агрессивности [52], предрасположенности к потреблению этанола[56], в развитие физической зависимости от этанола[14, 49, 52, 55], в ответ на различные стрессирующие воздействия [30, 33, 48, 52], введение стероидных гормонов in vivo [39], имеются данные о наличии половых различий в активности фермента [78].

В 1995 г. Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки основную КП, активность которой полностью подавляется ФМСФ [42].

Фермент, по результатам гель-фильтрации, имеет Мr 100000; проявляет максимальную активность при рН 6,0-6,5, но сохраняет 40-45% активности при рН 5,5. Фермент полностью ингибировался ФМСФ и ПХМБ, примерно на 40% ингибировался иодацетамидом. ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, ионы Co²⁺ и ГЭМЯК не влияли на его активность. Фермент почти в 2 раза активировался 50 мМ NaCl, несколько слабее – NaBr, KCl и KJ. Повышение концентрации NaCl не приводило к увеличению степени активации фермента [42, 47].

Согласно данным тонкослойной хроматографии частично очищенный фермент отщеплял аргинин от лей⁵-энкефалин-арг⁶ и дансил-фен-лей-арг с образованием лей⁵-энкефалин и дансил-фен-лей соответственно. Более глубокого гидролиза субстратов не наблюдалось. Фермент также не расщеплял субстрат КПA – карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Таким образом, по субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза сходна с ЛКПB. Вместе с тем физико-химические свойства фермента (ингибирование ФМСФ, нечувствительность к ЭДТА, ГЭМЯК и ионам Co²⁺) отличают его от ЛКПB [1, 192]. Ингибирование фермента ФМСФ позволяет предположить, что он является сериновой карбоксипептидазой. В тканях млекопитающих обнаружены две сериновые карбоксипептидазы – ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лизосомальная карбоксипептидаза L) и карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C, пролилкарбоксипептидаза). Но ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза отличатся от карбоксипептидазы C по молекулярной массе и субстратной специфичности [226, 249].

В то же время, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет сходные с ЛКПA молекулярную массу, оптимум pH, ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации [204, 226].

Активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех отделах мозга и в большинстве тканей, за исключением почек, в которых присутствуют лишь следы ее активности. Наибольшая активность фермента отмечается в надпочечниках, примерно на 40% ниже - в гипофизе, в печени и селезенке его активность составляет примерно 30-35% от активности в гипофизе. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2,5 раза ниже, чем в надпочечниках. В отделах мозга активность фермента примерно в 2-3 раза ниже, чем в гипофизе. Наиболее высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге обнаруживается в обонятельных луковицах, наиболее низкая - в четверохолмии и гиппокампе [35].

Обращает на себя внимание тот факт, что сродство обнаруженного фермента к дансил-фен-лей-арг (К_m гидролиза – 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (К_m гидролиза – 96 мкМ). Это позволяет предположить, что энкефалин-лей⁵-арг⁶ может быть лучшим субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП, чем для КПН. ФМСФ-КП проявляет существенную активность при значениях рН, соответствующих таковому внутри секреторных везикул. Таким образом, возможно, что обнаруженный фермент вовлекается в процессинг нейропептидов, в частности энкефалин-лей⁵-арг⁶, тем более, что в литературе имеются данные о том, что региональное распределение КПН и энкефалинов не всегда соответствует друг другу [75].

ФМСФ-КП вовлекается в развитие алкогольной зависимости [36, 37], в ответ на различные стрессирующие воздействия [13], обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП, причем у самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [44, 91, 139].