Карбоксипептидаза M (КФ 3.4.17.2)

1.6. Карбоксипептидаза M (КФ 3.4.17.2)

Карбоксипептидаза M представляет собой мембраносвязанный одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 62 кДа, заякоренный в плазматической мембране при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола [123, 248]. Обработка трипсином и фосфолипазой C приводит к удалению гидрофобного хвоста и высвобождению фермента из клеточной мембраны [121, 250].

Высвобождение КПM из плазматической мембраны происходит и in vivo, поскольку фермент обнаружен в различных биологических жидкостях, в частности в моче и амниотической жидкости [250].

При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков [245, 251]. Аминокислотная последовательность фермента на 41% идентична КПN и КПH, на 15% - КПB и КПA. Многие остатки активного центра идентичны таковым КПA и КПB, но перекрёстной реакции с антисыворотками к другим КП фермент не даёт [251, 260].

Фермент отщепляет остатки только основных аминокислот, при отсутствии ионов Co²⁺ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Co²⁺ - лизин. Эстеразная активность фермента значительно выше, чем пептидазная [123, 248]. КПM проявляет максимальную активность при pH 7,0, ионы Co²⁺ повышают активность фермента в 1,5-2 раза, причём степень активации возрастает при снижении pH [123]. Активность КПM подавляется ионами Cd²⁺, о-фенантролином, МГТК и ГЭМЯК [123, 248].

ПХМФС, HgCl₂, дитиотреитол, ФМСФ, апротинин, каптоприл и фосфорамидон не влияют на активность фермента [123, 248].

Фермент локализован преимущественно в плаценте, почках, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, обнаружен в периферической нервной системе и головном мозге[123, 212].

КПМ in vitro отщепляет С-концевые остатки основных аминокислот от динорфина А 1-13, мет-энкефалин-арг⁶, мет-энкефалин-лиз⁶, лей-энкефалин-арг⁶, брадикинина [1, 123, 248,], фактора роста эпидермиса [175], образует интактные кинины и анафилотоксины С3а, С4а, С5а [223]. Предполагают, что фермент может инактивировать или модулировать пептидные гормоны перед или после взаимодействия последних с рецепторами [28].

Стоит отметить, что если физико-химические свойства КПН, ФМСФ-КП и КПМ изучены достаточно хорошо, то биологическая роль данных ферментов, в том числе их участие в различных физиологических и патологических процессах исследованы значительно хуже. Поэтому представляется весьма интересным изучение их активности при различных процессах в организме, в том числе при острой алкогольной интоксикации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

Опыты проводили на самках и самцах белых беспородных крыс массой 150-200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

В работе использовали четыре группы животных. У самок крыс определяли стадию эстрального цикла по влагалищному мазку [59], при цитологическом исследовании которого животных разделяли на три группы. Животные первой группы находились в стадии диэструса, второй – в стадии проэструса, третьей – в стадии эструса, четвертую группу составляли самцы. Каждую из четырех групп разбивали на четыре подгруппы: первая – интактная. Животным второй подгруппы внутрибрюшинно вводили 5% раствор этанола, в дозе 1 г на кг веса тела, а животным третьей – 20% раствор этанола в дозе 4 г на кг веса. Животным четвертой подгруппы вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора. Животных декапитировали через 0,5 часа, 4часа и 18 часов после инъекции. Декапитацию самок крыс в стадии проэструса проводили только через 0,5 часа и 4 часа после инъекции, так как продолжительность данной стадии эстрального цикла около 12 часов. Затем извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в предварительно охлажденный физиологический раствор, очищали от кровеносных сосудов и оболочек, высушивали фильтровальной бумагой.

Для определения активности ферментов ткани взвешивали, а затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl в соотношении 1:100 (вес:объем) для отделов мозга, надпочечников и яичников, 1:50 для семенников.

В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (“Serva”, США) и ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым). Субстраты дансил-фен-ала-арг, дансил-фен-лей-арг были синтезированы к.х.н. В.Н. Калихевичем. Для внутрибрюшинных инъекций применялся дважды перегнанный медицинский спирт. В работе использовали ацетат натрия (“Merck”, Германия), трис-НСl (“Serva”, США), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λ_ex=360 нм и λ_em=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.