Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

3.1.2. Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных самок крыс

В ходе проведения эксперимента достоверное изменение активности ФМСФ-КП обнаружено только в яичниках. В этом органе активность фермента на стадии проэструса и эструса была в 1,7 и 1,9 раза соответственно выше по сравнению с диэструсом (табл.5).

Наличие зависимости активности ФМСФ-КП от стадии эстрального цикла в яичниках позволяет предположить, что, вероятно, она, наряду с КПН, может вовлекаться в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе, а также в процессы развития фолликула и желтого тела.

Таблица 5. Активность ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M±m, n=6¸8).

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок

На стадии диэструса в гипофизе через 4 после введения физраствора активность ФМСФ-КП уменьшалась на 46% по сравнению с интактными животными. В стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента была выше на 31%, чем в норме. В надпочечниках через 0,5 и 18 часов после введения физиологического раствора наблюдалось повышение активности фермента на 70% и 50% соответственно. В яичниках через все исследуемые интервалы времени активность ФМСФ-КП была увеличена: через 0,5 часа в 2,9 раза, через 4 часа в 4,1 раза, через 18 часов в 8,5 раз по сравнению с интактными самками. В гипоталамусе отличий от нормы после введения физраствора не обнаружено (рис. 2).

На стадии проэструса в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках инъекция изотонического раствора NaCl не изменяла активность ФМСФ-КП. В стриатуме через 0,5 и 4 часа отмечено снижение активности ФМСФ-КП на 24% и 28% соответственно, а в яичниках увеличение активности фермента через те же промежутки времени в 4,2 и 3 раза соответственно по отношению к интактным крысам.

На стадии эструса в гипофизе активность ФМСФ-КП после введения физиологического раствора уменьшалась через 0,5 и 18 часов на 32% и 45% соответственно по сравнению с нормой. В гипоталамусе и стриатуме снижение активности происходило только через 18 часов после инъекции физраствора на 25% и 33% соответственно. В яичниках через 0,5 часа после введения физиологического раствора активность ФМСФ-КП не отличалась от нормы, через 4 часа была выше на 339%, а через 18 часов ниже на 35% по сравнению с нормой. В надпочечниках введение физиологического раствора не влияло на активность ФМСФ-КП.

Сравнение активности ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора выявило, что в гипофизе через 4 часа после инъекции активность фермента на стадии эструса достоверно выше, чем в диэструсе, через 18 часов после воздействия соотношение активностей ФМСФ-КП на этих стадиях меняется на противоположное.

В гипоталамусе и надпочечниках через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность в фермента в эструсе и проэструсе ниже, чем в диэструсе; через 4 часа наблюдается более высокая активность в эструсе по сравнению с проэструсом, а через 18 часов на стадии эструса она ниже, чем в диэструсе.

В стриатуме через 0,5 часа в эструсе и диэструсе активность ФМСФ-КП была более высокой, чем в проэструсе. Через 4 часа после внутрибрюшинной инъекции активность фермента уменьшалась в ряду: эструс-диэструс-проэструс. В надпочечниках через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl активность ФМСФ-КП в эструсе была выше по сравнению с диэструсом и проэструсом. В яичниках через 0,5 после инъекции физраствора наиболее высокая активность фермента наблюдалась в проэструсе, самая низкая – в эструсе и была промежуточной по своему значению в диэструсе, через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в проэструсе, где в свою очередь активность фермента была выше, чем в диэструсе. Через 18 часов после внутрибрюшинного введения физиологического раствора в яичниках активность ФМСФ-КП в эструсе была ниже по сравнению с диэструсом.

Таким образом, инъекция физраствора вызывает изменение активности ФМСФ-КП во всех исследуемых отделах и приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме, надпочечниках, чего не наблюдалось у интактных крыс, что, по-видимомому, приводит к изменению соотношения различных нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла и приводит к нарушению овуляции и другим аномалиям в функционировании половой системы [2, 73].

в) Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс

В диэструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента возрастала в гипофизе и яичниках через 0,5 часа на 55% и 252%, через 4 часа на 116% и 89% соответственно, но не отличалась от контроля через 18 часов. В других исследованных органах активность ФМСФ-КП возрастала только через 4 часа после инъекции этилового спирта в дозе 1г/кг: в гипоталамусе на 36%, в стриатуме на 26% и в надпочечниках на 55% по сравнению с контрольной группой животных (рис.2).

На стадии диэструса при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа активность ФМСФ-КП была выше, чем в контроле в гипофизе на 128%, в гипоталамусе на 46%. Через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента снижалась в гипофизе на 50%, в гипоталамусе на 38% по отношению к контрольным самкам. В яичниках наблюдается постепенное снижение активности ФМСФ-КП во времени: через 0,5 часа активность фермента выше контрольных значений в 4,4 раза, через 4 часа в 1,5 раза, а через 18 часов ниже контроля в 9,5 раз.

Стоит отметить, что введение этанола в дозе 4 г/кг в диэструсе не приводило к изменению активности ФМСФ-КП в стриатуме и надпочечниках через все исследованные промежутки времени.

Таким образом, на стадии диэструса наиболее существенные изменения в активности фермента наблюдались в яичниках.

Достоверные различия во влиянии разных доз спирта на активность ФМСФ-КП обнаружены в гипофизе через 0,5 часа, в стриатуме через 0,5 и 4 часа, в гипоталамусе и яичниках через 18 часов после инъекции. При этом этанол в дозе 1 г/кг в гипофизе и стриатуме через 4 часа активировал ФМСФ-КП, но не изменял активность фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг по сравнению с контрольными животными. В стриатуме большая доза этанола через 0,5 часа после воздействия сильнее активировала фермент, чем меньшая. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг не было обнаружено изменения активности, однако при увеличении дозировки этилового спирта наблюдалось уменьшение активности ФМСФ-КП по отношению к контрольным самкам. После введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в яичниках не отличалась от контроля, но была в 7,8 раза выше по сравнению с активностью фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг.

Таким образом, на стадии диэструса этанол в дозе 1 г/кг повышал или не оказывал влияния на активность фермента, а в дозе 4г/кг оказывал разнонаправленное воздействие.

Результаты дисперсионного анализа влияния времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе выявили, что активность зависела от времени при введении физиологического раствора и этанола в дозе 4г/кг в гипофизе и гипоталамусе (табл.6). В стриатуме влияния времени на активность фермента не обнаружено. В надпочечниках зависимость от времени после введения растворов этилового спирта и хлорида натрия оказалась сходной: при введении физраствора активность увеличивалась к 0,5 часа, несколько снижалась к 4 часам и в интервале 4 –18 часов достоверно не изменялась, в случае введения этанола снижение наблюдалось при переходе к 18 часам. В яичниках введение физраствора вызывало постепенное увеличение активности ФМСФ-КП; через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента увеличичалась и оставалась на этом уровне вплоть до 18 часов. Введение этанола в дозе 4 г/кг приводило к тому, что активность фермента в яичниках резко увеличивалась через 0,5 часа, а затем постепенно снижалась, достигая к 18 часам исходного уровня.

В проэструсе этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП в гипофизе и яичниках.

Таблица 6. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 24% и 36% выше, если доза этанола составляла 4 г/кг, то активность фермента была на 52% и 61% соответственно выше по сравнению с контрольной группой животных.

На стадии проэструса в надпочечниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 25%, а через 4 часа на 19% выше, чем в контроле. Повышение активности ФМСФ-КП согласуется с данными об увеличении синтеза и секреции энкефалинов, β-эндорфина, АКТГ, пролактина при острой алкгольной интоксикации [94, 158, 241] и позволяет предположит причастность этого фермента к процессингу регуляторных пептидов.

Этанол в дозе 4 г/кг снижал активность фермента относительно контрольной группы в гипофизе, надпочечниках и яичниках через 0,5 часа в 2,2, 1,9 и 5,5 раз соответственно. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа наблюдалась активация ФМСФ-КП на 52%, 61% и 63% соответственно по отношению к контрольной группе.

Таким образом, на стадии проэструса при введении этанола в дозе 1 г/кг наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в стриатуме, а при введении этанола в дозе 4 г/кг – в яичниках. Кроме того, этанол в большей дозе вызывал более значимые сдвиги в активности фермента, что согласуется с мембранотропным эффектом этанола, сила которого увеличивается с ростом концентрации алкоголя [10,19, 88].

В проэструсе обнаружено достоверное отличие в действии, которое оказывают разные дозы алкоголя: в гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг ФМСФ-КП активируется сильнее, чем при инъекции этанола в дозе 1 г/кг. Кроме того, в яичниках через 0,5 часа под влиянием этанола в дозе 4 г/кг активность фермента уменьшалась, а при внутрибрюшинной инъекции этанола в дозе 1 г/кг не отличалась от контрольных значений; через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг наблюдалось увеличение активности фермента, а при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг отличий от контроля зафиксировано не было.

Согласно результатам дисперсионного анализа в проэструсе зависимость активности ФМСФ-КП от времени после воздействия в гипофизе и надпочечниках наблюдается только при введении этанола в дозе 4 г/кг (табл. 7). В гипоталамусе на стадии проэструса активность фермента не зависела от времени. В стриатуме зависимость обнаружена только при введении физиологическго раствора (активность ФМСФ-КП с течением времени уменьшается), тогда как в яичниках активность фермента

Таблица 7. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в проэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

изменялась с течением времени при введении как физраствора, так и растворов этилового спирта.

На стадии эструса после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в контрольной группе животных через 0,5 и 4 часа на 61%, а через 18 часов на 133%. Через 0,5 и 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше, чем в контроле: в надпочечниках на 47% и 78%, а в яичниках в 5,2 и 5,1 раза соответственно. В гипоталамусе активность ФМСФ-КП возрастает через 4 и 18 часов после инъекции алкоголя в дозе 1 г/кг на 35% и 68% соответственно.

В эструсе введение этанола в дозе 4 г/кг не изменяло активность ФМСФ-КП в гипофизе через 0,5 часа после инъекции, уменьшало активность фермента через 4 часа на 25% и повышало через 18 часов на 124% по отношению к контрольной группе животных. В гипоталамусе под действием той же дозы этанола активность фермента увеличивалась только через 18 часов после оказанного воздействия на 82%. В стриатуме и надпочечниках активность ФМСФ-КП имела U-образную зависимость от времени после введения этанола (доза 4 г на кг): повышение активности через 0,5 часа на 66% и 25% и через 18 часов на 82% и 58% и снижение активности через 4 часа на 46% и 28% соответственно по отношению к контрольным крысам. В яичниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП снижалась на 36%, через 4 часа не было достоверных отличий, а через 18 часов – повышение активности в 5,8 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, на стадии эструса при введении этанола наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в гипофизе и яичниках.

Обнаружены статистически значимые различия во влиянии различных доз этанола. Так в гипофизе алкоголь в дозе 1 г/кг через 0,5 и 4 часа после инъекции повышал активность ФМСФ-КП, а в дозе 4 г/кг, напротив, понижал по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе через 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола меньшая доза вызывала активацию фермента в отличие от большей, под действием которой активность по отношению к контролю не менялась. В стриатуме и надпочечниках две дозы этанола также оказывали разное влияние: при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа не было изменений в активности ФМСФ-КП, в то время как его инъекция в дозе 4 г/кг вызывала снижение активности фермента.

Таким образом, в эструсе, также как и на стадии диэструса, введение этанола в меньшей дозе либо не вызывало изменений в активности ФМСФ-КП, либо приводило к ее увеличению, в то время как инъекция большей дозы могла приводить и к снижению активности фермента.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении физраствора и различных доз этанола на стадии эструса показал, что в гипофизе и стриатуме зависимость от времени обнаруживалась при инъекции физиологического раствора и этанола в дозе 4 г/кг, однако активность ФМСФ-КП не зависела от времени после введения этанола в дозе 1 г/кг (табл.8).

Таблица 8. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в эструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе зависимость от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг, а в надпочечниках ее не выявили. В яичниках на стадии эструса при введении физраствора активность возрастала при переходе от 0,5 часа к 4 часам, а к 18 часам снижалась до исходного уровня. При введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента резко возрастала к 0,5 часа, оставалась на высоком уровне вплоть до 4 часов и несколько снижалась к 18 часам, но все же оставалась выше исходной

Следует отметить, что активность ФМСФ-КП при введении растворов этанола сильно изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла, таким образом, ответная реакция на острую алкогольную интоксикацию, вероятно, определяется стадией эстрального цикла.

Так в гипофизе, яичниках (доза 1 г на кг) и надпочечниках (доза 4 г на кг) через 0,5 часа после инъекции этанола самая высокая активность ФМСФ-КП была в диэструсе, самая низкая в проэструсе и промежуточной по своему значению в эструсе. В гипофизе через 4 часа, в гипоталамусе через 0,5 часа, а в стриатуме и надпочечниках через оба этих промежутка времени после введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в диэструсе и эструсе по отношению к проэструсу. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1г/кг в гипофизе активность фермента на преовуляторной стадии цикла была более высокой, чем после овуляции, а через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП в диэструсе была выше, чем на других стадиях.

В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе, чем в проэструсе и диэструсе. В том же отделе головного мозга через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента в эструсе больше, чем в диэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках после инъекции этанола (доза 4 г/кг) через 18 часов, а в последнем органе и через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в диэструсе. В надпочечниках через 4 часа и в яичниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента в проэструсе и эструсе была ниже по сравненению с диэструсом.

Интересно отметить, что если в норме достоверные изменения активности ФМСФ-КП в зависимости от стадии эстрального цикла были обнаружены только в яичниках, то при введении физраствора или этанола такая зависимость появлялась во всех исследованных органах. Причем, как правило, в диэструсе и эструсе активность фермента была выше, чем в проэструсе. Разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП, наблюдаемые на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о различном уровне алкогольной мотивации крыс на разных этапах полового цикла.

Итак, при введении этанола наиболее значительные изменения в активности ФМСФ-КП были обнаружены в гипофизе и яичниках, тем самым подтверждает тезис о том, что первое место в реестре эндокринопатий при острой алкогольной интоксикации занимает поражение гипофизарно-гонадальной системы.

На стадии диэструса активность фермента зависела от дозы вводимого этанола во всех отделах, кроме надпочечников, в эструсе такая зависимость не обнаруживалась только в яичниках, а в проэструсе была выявлена в гипоталамусе и яичниках. Зависимость активности ФМСФ-КП от времени в гипофизе при введении физраствора обнаруживалась на всех стадиях эстрального цикла, а при введении этанола (доза 4 г на кг) – только в эструсе, в яичниках активность фермента изменялась с течением времени, как при инъекции физраствора, так и этилового спирта. В гипоталамусе зависимость активности ФМСФ-КП от времени выявлена в диэструсе при введении физраствора, и в эструсе при введении этанола в дозе 4 г/кг, в стриатуме активность фермента зависела от времени только в эструсе после инъекции раствора хлорида натрия и этанола (доза 4 г на кг). В надпочечниках подобная зависимость выявлена в диэструсе после инъекции как физраствора, так и этилового спирта и в проэструсе при введении физиологического раствора.

Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности ФМСФ-КП, причем характер этих изменений определяется отделом, в котором исследуется активность ФМСФ-КП, стадией эстрального цикла, дозой вводимого этанола и временем, через которое проводится определение активности фермента.