Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы

2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы

Активность ФМСФ-КП определяли флюориметрически [42] с использованием дансил-фен-лей-арг в качестве субстрата.

В контрольные пробы вносили 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарата фермента и 10 мкл 25 мМ ФМСФ, приготовленного на этаноле. ФМСФ вносили в реакционную смесь после внесения препарата фермента. Опытные пробы содержали 150 мкл указанного буфера и 50 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37^oC, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37^oC 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH и КПМ. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-лей в хлороформе.

Активность фермента определяли как разницу прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [195].

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.

2.3. Схема эксперимента

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н

в тканях интактных самок крыс

Результаты исследований показали, что в зависимости от стадии эстрального цикла меняется активность КПН в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и яичниках (табл.1).

Разные стадии эстрального цикла могут быть расположены по мере убывания активности КПН в гипофизе в ряд: проэструс-эструс-диэструс.

Таблица 1. Активность КПН на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M±m, n=6¸8).

Примечание. Здесь и в табл. 5 достоверность отличий критерия Стьюдента по сравнению с диэструсом и проэструсом: < – p<0,05, << – p<0,01 и ^ – p<0,05, ^^ – p<0,01, ^^^ – p<0,001 соответственно.

Известно, что стадия проэструса характеризуется наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника, а стадия диэструса низким уровнем эстрогенов в организме [12, 17, 45]. В свою очередь секреция эстрогенов находится под влиянием ФСГ и ЛГ, концентрация которых также возрастает в проэструсе и уменьшается в диэструсе [11, 46]. Эти данные позволяют предположить, что КПН, возможно участвует в регуляции уровня этих гормонов в гипофизе на разных стадиях эстрального цикла.

Активность КПН в гипоталамусе на стадии эструса выше чем на стадии проэструса на 17%. В стриатуме в эструсе активность фермента выше по отношению к диэструсу на 27%. Так как КПН вовлекается в процесс биосинтеза энкефалинов, то, возможно, что такое увеличение активности фермента, приводящее к росту содержания энкефалинов в стриатуме, объясняет существенное снижение добровольного потребления этанола самками крыс в эструсе [19, 45].

В надпочечниках достоверных изменений активности КПН в зависимости от стадии эстрального цикла не выявлено.

В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше, чем в диэструсе, что позволяет предположить возможность вовлечения фермента в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе [18, 240].

Таким образом, вероятно, КПН принадлежит важная роль в регулировании уровня нейрогормонов на разных стадиях эстрального цикла.

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок

На стадии ДЭ через 4 часа после введения физиологического раствора активность КПН изменялась в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках (рис. 1). При этом в гипофизе она возросла почти в 2 раза, а в гипоталамусе и надпочечниках уменьшилась на 29% и 51% соответственно. Уменьшение активности КПН в гипоталамусе, вероятно, может способствовать увеличению количества выводимой из организма жидкости, за счет уменьшения образования вазопрессина [72]. Через 0,5 и 18 часов после инъекции достоверных изменений активности КПН не обнаружено. В стриатуме и яичниках введение физиологического раствора не влияло на активность КПН.

На стадии проэструса активность КПН в гипофизе через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора была достоверно ниже на 35% и 53% соответственно по сравнению с интактными самками. В надпочечниках снижение активности КПН отмечено только через 0,5 часа после инъекции физраствора на 34% по сравнению с интактной группой крыс. Вероятно, такие изменения активности фермента связаны с особенностями оказываемого воздействия, при котором в организм поступает дополнительное количество жидкости [38]. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора.

На стадии эструса в гипофизе через 0,5 и 4 часа после введения физраствора активность КПН была ниже нормы на 48% и 42% соответственно. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции активность КПН была ниже на 25% по сравнению с интактной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора.

Сравнение активности КПН на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора показало, что на стадии эструса в гипофизе через 0,5 часа после оказания воздействия активность фермента достоверно ниже по отношению к диэструсу и проэструсу. Через 4 часа после введения физраствора активность уменьшалась при переходе от диэструса к проэструсу и далее к эструсу. В гипофизе через 18 часов после инъекции активность КПН была достоверно выше в диэструсе по сравнению с эструсом.

В гипоталамусе на стадии эструса через 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность КПН выше, чем в диэструсе и проэструсе, а через 18 часов в диэструсе ниже, чем в эструсе.

В стриатуме на стадии диэструса через 0,5 часа после инъекции 0,9 % раствора NaCl активность фермента была выше, чем в проэструсе. Через 4 часа после оказанного воздействия в стриатуме активность КПН в эструсе достоверно выше по отношению к диэструсу и проэструсу, через 18 часов активность фермента в эструсе продолжала оставаться на более высоком уровне, чем в диэструсе.

В надпочечниках на стадии диэструса активность КПН через 0,5 часа после введения физиологического раствора достоверно выше, чем в эструсе и проэструсе, а через 4 часа соотношение активностей фермента на этих стадиях меняется на обратное.

В яичниках на стадии проэструса активность КПН достоверно выше, чем на стадии эструса. Через 4 и 18 часов в диэструсе активность ниже по сравнению с эструсом. Таким образом, введение физраствора приводит к изменению соотношения активности фермента в исследуемых отделах в ходе эстрального цикла и ведет в свою очередь к изменению соотношения нейропептидов, что, вероятно отражает один из механизмов нарушения функционирования половой системы при стрессе.

Введение физраствора не оказывало влияния на активность КПН через 0,5 часа после воздействия на стадии диэструса и через 18 часов на стадиях диэструса и эструса. Активность КПН в яичниках не зависела от инъекции физраствора. Наиболее существенные изменения после введения физраствора в активности фермента наблюдались в гипофизе и менее существенные в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, причем во всех этих отделах, за исключением активности фермента в гипофизе через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl, активность фермента была ниже, чем у интактных животных. Кроме того, активность КПН при внутрибрюшинном введении физиологического раствора во всех изученных отделах зависела от стадии эстрального цикла. Все это приводит к тому, что после инъекции физраствора соотношение активностей фермента в зависимости от стадии эстрального цикла во всех органах отличается от нормы.

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс

На стадии диэструса в гипофизе через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г на кг веса наблюдалось снижение активности КПН на 33% по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках через тот же промежуток времени активность фермента была выше, чем у контрольной группы животных на 33%, 47% и 112% соответственно. В гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции раствора этанола активность КПН была выше на 37% по сравнению с контрольными самками (рис.1). Наши данные согласуются со сведениями об усилении образования и секреции энкефалинов, АКТГ, β-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [94, 158, 241], в биосинтезе которых принимает участие КПН [27, 28, 29].

Этанол в дозе 4 г/кг в диэструсе измененял активность фермента в гипофизе: через 0,5 и 18 часов она была выше контрольных значений на 43% и 140% соответственно, а через 4 часа – ниже на 57%. В гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после введения этанола активность КПН была выше на 26% и 38% соответственно, а через 18 часов – ниже на 31% по сравнению с контрольной группой животных. Снижение активности фермента, возможно, направлено на нормализацию пептидэргических систем. В яичниках только через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг активность фермента была выше таковой по сравнению с контролем в 3,6 раза. Увеличение активности КПН при острой алкогольной интоксикации согласуется с представлением об активации многих пептидэргических систем при острой алкогольной интоксикации [19, 86].

Интересно отметить, что в стриатуме на стадии диэструса этанол не оказывал влияния на активность КПН, что, вероятно, может объясняться особенностями биохимического и физиологического статуса животных на разных стадиях эстрального цикла [17, 45, 247].

Достоверные отличия в активности КПН в стадии диэструса при введении различных доз этанола обнаружены в гипофизе и гипоталамусе через 18 часов, а также в яичниках через 0,5 часа после инъекции. При этом этанол в дозе 1г/кг не вызывал изменений в активности фермента, однако при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПН возрастала в 2 раза в гипофизе, в 2,8 раза в яичниках и уменьшалась в гипоталамусе на 23%.

Таким образом, введение этилового спирта на стадии диэструса вызывает разнонаправленные изменения активности КПН. Кроме того, через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента оставалась на прежнем уровне во всех рассмотренных отделах.

Для более полного понимания характера выявленных изменений активности фермента первичный экспериментальный материал был подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции при введении различных доз этанола (табл.2).

Дисперсионный анализ показал отсутствие влияния времени на активность КПН при введении физиологического раствора и этанола в дозе 1г/кг в диэструсе. Однако при инъекции этанола в дозе 4 г/кг наблюдается достоверная зависимость активности КПН от времени в гипофизе и гипоталамусе. При этом этанол в дозе 4г/кг вызывал в гипофизе U-образное изменение активности фермента, а в гипоталамусе активность фермента плавно снижалась с течением времени.

Таблица 2. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в диэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

Примечание. Здесь и в табл.3-4, 6-8, 10-12, 14, 16, 18, 19 показана достоверность критерия Фишера: ^* - p<0,05, ^** - p<0,01, ^*** - p<0,001; прочерк - определение не проводилось.

На стадии проэструса активность КПН при введении этилового спирта (доза 1г на кг массы тела) в гипофизе через все исследованные промежутки времени была ниже контрольных значений: на 45% через 0,5 часа и на 24% через 4 часа. В других отделах этанол в дозе 1г/кг не изменял активность КПН относительно контроля.

В дозе 4г/кг в проэструсе этанол вызывал снижение активности в гипофизе через 0,5 часа и в надпочечниках через 4 часа на 32% и 48% соответственно по сравнению с контрольной группой крыс. В яичниках через