Выделение чистой культуры дрожжевых грибов

3 Выделение чистой культуры дрожжевых грибов

В зависимости от программы исследований выбирают тот или иной метод отбора образцов, позволяющий либо только обнаружить и количественно учесть дрожжевые организмы в анализируемом субстрате, либо обнаружить для накопления их биомассы. В разных областях научных исследований и каждой отрасли промышленности имеются свои указания относительно деталей правильного отбора проб для микробиологического анализа. (И.П. Бабьева, В.И. Голубев, 1979).

Поверхность твердого тела. Ее исследуют путем получения смыва, отпечатка или соскоба.

Смыв производят стерильной водой непосредственно с объекта, помещая его в сосуд или же при больших размерах объекта пользуясь ватными или марлевыми тампонами. Такие тампоны затем опускают в суспензионную жидкость, встряхивают и делают высев. Недостатки этого метода заключаются в том, что его, во первых, трудно стандартизовать (разные люди прикладывают разные усилия при смыве ) и во вторых, вата активно сорбирует клетки микроорганизмов и суспензия получается обедненной. Для количественного учета эта техника непригодна. Несмотря на указанные недостатки ,различные методы смыва остаются на более распространенными в области медицинской и санитарной микробиологии, а также при изучении эпифитной флоры зеленых растений. В последнем случае используют непосредственный смыв без тампонов путем нанесения целых листьев или их частей в колбы с водой. При сравнительных исследованиях из листа вырезают пластинки стандартной площади, чтобы можно было сделать пересчет числа микроорганизмов на 1см ² . листья или вырезанные из них пластинки встряхивают в колбе с водой 10 минут на качалке, а затем делают. (В.Г. Бабицкая, И.В. Стахеев 1977).

Растирание материала, которое иногда рекомендуют, не всегда желательно, так как при этом освобождаются токсические вещества, фитонциды, которые могут оказать губительное действие на микробные клетки.

Метод смыва с поверхностей применяют при исследовании таких объектов, как плоды и овощи, зерно и сметана, мясо и шкуры и тому подобное, а также с оборудования. (В.А. Быков и др. 1987).

Соскоб производят стерильным скальпелем непосредственно в сосуд со стерильной водой. Суспензию перед посевом либо встряхивают 10 минут, либо обрабатывают 5 минут на микроразмельчителе тканей.

Отпечатки приготовляют прямыми или опосредованными методами.

Прямые методы основаны на снятии дрожжевых клеток с исследуемой поверхности различными прозрачными адгезивными материалами: Коллодиевой пленкой бесцветным лаком, липкой целлофановой лентой, полиэтиленовой пленкой, смазанной клеящим веществом. Полученные отпечатки просматривают под микроскопом опуская пленки в капли воды или лактофенола на предметном стекле. (В.Г. Бабицкая, И.В. Стахеев 1977).

Липкой лентой можно снимать и предварительно нанесенную на поверхность объекта тонкую агаровую пленку. Полоску ленты с агаром и прикрепившимися к нему дрожжевыми клетками, рассматривают затем под микроскопом без проращивания. Методы получения отпечатков имеют некоторые общие недостатки: далеко не все клетки снимаются с исследуемой поверхности; при густой обсемененности клетки могут располагаться слишком близко друг от друга и их трудно учитывать. При получении отпечатка с последующим проращиванием исследуемый объект прижимают к поверхности плотной питательной среды, а затем его удаляют, и чашки со средой ставят в термостат. Таким образом удается хорошо наблюдать плотность заселения и характер распределения дрожжей на поверхности листовой пластинки. Если объект большого размера, то поступают наоборот: к нему прижимают приготовленную среду, пользуясь методом агаровой колбаски. Колбаски делают из разных питательных агаров, запечатывая их стерильно в пергаментную обертку. Срезая последовательно круглые ломтики, их 4 размещают в стерильные чашки Петри и проращивают во влажной камере. (И.П. Бабьева и В.И. Голубев1987).

Отпечатки можно получать с помощью мягких пластичных материалов, таких как бархат, замша, вельвет из которых делают круглые подушки - репликаторы. Лучше всего использовать - бархат велюр, белый или бледно желтый (другие краски могут быть токсичны).Бархат первоначально кипятят, режут круглые куски и приклеивают их к алюминиевым дискам такого размера чтобы они помещались в чашку Петри. (А.Ю. Жвиблянская, В.С. Исаева, 1979).

Стерилизую завернутыми в бумагу сухим жаром при 160^оС 1 ч. Перед использованием поверхность бархата смачивают жидкой питательной средой и прикладывают его к исследуемому объекту на несколько секунд. Затем не сдвигая! Осторожно отнимаю и переносят в чашку Петри. Отпечатки делают на серии чашек с одной или разными средами. После употребления репликаторы стерилизуют в сосудах с водой автоклавированием 20 мин при 120^оС, подсушивают и расправляют бархат шпателем. Особенно удобно пользоваться мягкими репликаторами при работе с неровными и шероховатыми поверхностями.

Сыпучие и плотные субстраты. Их берут для анализа в стерильные пергаментные пакеты. Влажные пробы отбирают в стерильные стеклянные банки или новые полиэтиленовые пакеты. Отбор проб ила со дна водоемов производят статометром, или дночерпателем. В других случаях пробы можно брать специальной ложкой, ножем или шпателем, которые предварительно протирают спиртом и обжигают. (С.А. Коновалов, 1962).

При сборе образцов почв для экологического исследования соблюдают специальные правила, гарантирующие репрезентативной выборки.

Прозрачные жидкости и взвеси. Присутствие дрожжей в них можно установить непосредственно под микроскопом или после концентрирования на центрифугах при частоте вращения 2000 об/мин в течении 15-20 мин.

Пробу воды и жидкостей отбирают в стерильные сосуды. Воду из природных водоемов берут специальными приборами-батометрами. Из них воду фильтруют через мембранные фильтры с порами диаметром 1,2 мкм. Далее фильтры либо помещают на поверхность питательных сред для проращивания клеток дрожжей, либо окрашивают и наблюдают под микроскопом. Можно брать два фильтра: один для проращивания и окраски, а другой (нижний) для контроля на пропускание.

Масла и эмульсии, включая сливочное масло и мороженое, можно также исследовать методом мембранных фильтров после обработки их эмульгаторами. Жидкости и взвеси необходимо анализировать вскоре после отбора проб, а при невозможности этого хранить в холодильнике не более 1-2 сут, так как далее первоначальное количество дрожжей в них может существенно измениться. (М.И. Ратнер и Каннель Э.С.).

Воздух. Методы анализа воздуха основаны либо на осаждении аэрозолей, либо на фильтрации его через жидкости или твердые фильтры.

Метод Коха основывается на свободном оседании микробных аэрозолей на поверхность питательной среды под влиянием гравитационных сил. Чашки со средой оставляют открытыми на 5-15 мин, а затем закрывают и помещают в термостат. Этот метод используют для обнаружения дрожжей в воздухе закрытых помещений при кратковременной экспозиции чашек. В открытых местах его использованию мешают горизонтальные потоки воздуха.

Все другие методы определения микроорганизмов в воздухе основан на принудительном его токе, который создается разными способами.

Для санитарно-микологического контроля окружающей среды на предприятиях по производству белково-витаминных препаратов и кормовых дрожжей количественный учет дрожжей – продуцентов рода Сandida рекомендуется проводить щелевым методом на сусло-агаре и МБС – метабисульфитном агаре (МПА + 0,2% метабисульфита натрия ) с добавлением биомицина в количестве 100000 ед/л. Рост продолжается 48ч при 37°.(С Фениксова Р.В. 1973).

Для фильтрации воздуха через жидкости используют прибор Киктенко, основанный на осаждении микробных клеток в улавливающей жидкости, которую затем переносят по 0,1 – 0,3 мл на плотную среду и проращивают.

Общий принцип посевов заключается в том, что образец превращают в такое состояние, когда он может быть серийно разведен, чтобы сделать из него высев или сразу в чашки, или перевести клетки сначала на мембранные фильтры. (Коновалов С.А. 1962)

В качестве суспензионных жидкостей используют стерильную водопроводную воду, в которую иногда добавляют поверхностно-активные вещества (например, Твин-80, 1капля на 0,5 л), 0,5%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде (при выделении психрофильных дрожжей).

Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке.

После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки.

При инкубировании посевов большое значение имеет поддержание определенной температуры. Преобладающее число видов дрожжей относится к группе мезофильных микроорганизмов с температурными границами роста от 2 – 5 до 30 – 37°С и оптимумом при 26 – 28°С. Среди дрожжей нет истинных термофилов, для роста которых требуются температуры выше 50°С. При выращивании дрожжей при температуре 40 – 45°С необходимо добавлять в среду олеиновую кислоту.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.)

Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования. Из теплокровных животных и из различных органов человека и связанных с ним субстратов дрожжи выделяют при 37°С, если хотят найти патогенные формы, и при 28°С в случае поиска сапрофитных видов. Если дрожжи растут при 37°С, то требуется соблюдать осторожность, так как среди них могут быть патогенные – Cryptococcus neoformans или Candida albicans (=Syringospora albicans).

Посевы из материала, где предполагается наличие психрофильных дрожжей, инкубируют в холодильнике при температуре 4 – 5°С.( Коновалов С.А. 1967).

Сроки инкубирования непосредственно зависят от температуры. При 37°С инкубируют не более 4, а в холодильнике не менее 14 сут. Если дрожжи дают визуально заметный рост при 4 – 5°С в течение 7 – 10 дней, то их относят к истинным психрофилам при условии, что выше 20°С они не растут. Температурный оптимум таких дрожжей находится обычно в диапазоне от 10 до 15°С. Психротолерантные дрожжи вырастают при 5°С в течение 2 – 3 недель, а психрофобные при температуре ниже 30°С не растут совсем. В посевах из почвы, инкубируемых при низких температурах, удается учесть в 2 – 3 раза больше дрожжей, чем при 28°С, так как росту дрожжевых колоний при этом не мешают грибы с быстро распространяющимся мицелием. Учет опытов в этих случаях следует производить дважды – через две недели и через месяц.

Стандартные полноценные питательные среды. Эти среды применяют с целью наиболее полного учета и выделения большинства видов дрожжей. Наиболее широко используемой полноценной средой для выращивания дрожжей является солодовое сусло. В его состав входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза и мальтотетраоза, а также небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза и рибоза. Азотные компоненты составляют 6 – 7% сухих веществ (СВ), среди них аммонийного азота 2,18 – 2,44 мг на 100 мл. В сусле имеются аминокислоты, все основные витамины группы В и минеральные вещества, содержание которых зависит от используемой воды.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Сусло получают с пивоваренных заводов неохмеленное, после фильтрации. Его разводят водопроводной водой до концентрации 6 – 8% СВ.

Для приготовления сусла в лаборатории используют ячменный солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. В 1 л воды вносят 250 г солода и нагревают до 50°С. Через 30 мин постепенно поднимают до 62,5 – 63°С и не снижают до исчезновения реакции на крахмал (йодная проба). Полученное сусло отделяют от дробины путем фильтрации через марлю и вату, разбавляют водой до нужной концентрации, разливают по колбам и стерилизуют при 112°С 30 мин. Если рН ниже 5,5, то сусло подщелачивают 10%-ным раствором соды или едкого кали до получения рН 5,6 – 6,0. Сусло очищают от примесей кизельгуром или отстаиванием в холодильнике с фильтрацией. Для приготовления плотных сред к суслу перед стерилизацией добавляют 2% агара или 20% желатины.( Быков В. А.).

Сусло-агар можно приготовить из сухого солодового экстракта, 20 г порошка растворяют в 400 мл горячей дистиллированной воды, содержащей 12 г агара, и стерилизуют при 121°С 15 мин.

Из синтетических сред наиболее часто для дрожжей используют агар Сабуро, называемый также глюкозо-пептонной средой, со следующим составом(в г на 1 л водопроводной воды): глюкоза 40, пептон 10, агар 20.

Глюкозо-аммонийная среда содержит (в г на 1 л водопроводной воды) следующие вещества: Глюкоза − 20,0; (NH₄) ₂SO₄ − 5,0; KH₂PO₄ − 0,85; K₂HPO₄ − 0,15; MgSO₄ − 0,5; NaCl − 0,1; CaCl₂ − 0,1; Агар − 20,0;

Для обогащения факторами роста к этим средам добавляют иногда дрожжевой (0,2%) и мясной (0,3%) экстракты и виноградный сок (3%).

Дифференциальные среды. Их используют при выделении дрожжей из субстратов, сильно загрязненных другими микроорганизмами. Для подавления роста сопутствующих микроорганизмов к указанным выше питательным средам добавляют различные ингибиторы. Рост большинства бактерий и актиномицетов подавляется при низком значении рН среды, поэтому чаще всего среды для выделения дрожжей подкисляют до рН 4,5 путем добавления к ним органических кислот. Для синтетических сред наиболее применима соляная кислота, для сусловых молочная, лимонная или винная. Для подкисления заводского солодового сусла (6 – 8% СВ) обычно требуется 3 – 4 мл/л концентрированной молочной кислоты. Кислоты добавляют в жидкую или расплавленную агаровую среду после стерилизации, непосредственно перед засевом или перед разливкой в чашки Петри. Все дрожжи, кроме Schisosaccharomyces pombe (рН 5,45), растут при рН до 2,5. Если брать 3% агара, то среда застывает при рН 4,8. (Градова Н. Б).

Вместо кислот используют также антибиотики широкого спектра действия: стрептомицин (80мг/л или 100 ел/мл), пенициллин (20-100 ед/мл), левомицетин (50 мг/л) и др. Их можно добавлять в среду порознь и в комплексе. Например, против кислотоустойчивых бактерий применяют следующие смеси антибиотиков: актиномицин 2 мг/л +ауреомицин 50 мг/л; пенициллин 60 ед/мл +стрептомицин 100 ед/мл; левомицетин (хлорамфеникол) 20 мг/л +строптомицинсульфат 20 мг/л +хлортетрациклин солянокислый 100 мг/л.

Для отделения сахаромицетов от других дрожжей добавляют 2,5% этилацетата и рН до 4,0 доводят уксусной кислотой. Затем чашки герметизируют. При этих условиях колонии сахаромицетов появляются первыми.

Росту дрожжей на питательных средах при высеве из исходного материала зачастую препятствуют грибы с широко распространяющимися по поверхности субстрата мицелиальными колониями. Они имеют общие с дрожжами потребности в источниках питания, устойчивы к низким значениям рН среды и нечувствительны к действию указанных выше противобактериальных антибиотиков. Для ограничения роста микромицетов в среду добавляют специфические вещества: дифенил (0,005-0,01%), бычью желчь (0,25-0,5%), теллурат калия (0,05-0,15%), пропионат натрия (0,15-0,25%), – или некоторые красители: бром-крезоловый пурпурный (0,0025% или 2,5 мл/л 1% раствора), бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый (0,001%).( Грин Д.).

Элективные среды. Их применяют для дрожжей из специфических мест обитания.

Осмофильные дрожжи, обитающие в природе в гнездах диких пчел (в меде), обнаруживаемые в производстве сахара и при порче меда или других продуктов с большим содержанием сахара, выделяют на средах с высоким осмотическим давлением: на медовом и осмофильном агарах.

Состав сред: медовый агар: 70% меда в водопроводной воде и 2% агара; синтетический «медовый» агар: 60 г глюкозы, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г агара, 100мл воды; осмофильный агар: б сироп, содержащий 35 массовых частей сахарозы и 10 частей глюкозы, добавляют агар и стерилизуют 20 мин при 112°. Повторное расплавление не рекомендуется.

При выделении осмофильных дрожжей посевы делают на указанные среды и для сравнения – на обычные. Сахар, мед или сиропы растворяют в воде и фильтруют через мембранные фильтры, которые затем помещают для проращивания на агаровые среды. (Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С). Почвенные олигонитрофильные дрожжи Lipomyces выделяют на безазотистых средах. Примером такой среды может служить модифицированный агар Эшби (в г 1л дистиллированной воды) : Сахароза − 20,0; K₂HPO₄ − 0,2; KH₂PO₄ − 0,1 ; MgSO₄·7H₂O − 0,2 ; NaCl − 0,2; K₂SO₄ − 0,1 ; Агар − 20,0.

Для подавления роста бактерий к этой среде добавляют 80 мг/л стрептомицина. Посев производят комочками почвы: навеску в 100 мг распределяют на две чашки Петри, по 50 комочков на каждую. Для равномерного распределения используют трафарет, который подкладывают под чашку. Учет обрастаний производят через 25-30 сут. инкубирования при комнатной температуре. Результат выражают в процентах обрастания комочков почвы молочно-белыми слизистыми колониями липомицетов. (Коновалов С.А.).

Дрожжевые колонии в посевах учитывают следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяют чернилами на большее или меньшее число частей – от четырех до шестнадцати в зависимости от густоты посева – и просматривают все колонии на каждой площади с объективом 10× в просвечивающем микроскопе или с бинокулярной лупой в отраженном свете. Описывают все встречающиеся типы колоний в стандартных терминах. Из них готовят препараты и микроскопируют при больших увеличениях. Этот детальный просмотр колоний при первом посеве очень важен, так как при последующих пересевах некоторые признаки, например спорообразование, иногда исчезают. Рекомендуется сразу же делать фотографии или зарисовки. Колонии разных типов нумеруют и просчитывают отдельно.( Фениксова Р.В.).

Учет производят дважды. В первый срок отмечают с обратной стороны чашки все выросшие и просчитанные колонии, а за тем оставляют чашки еще на несколько дней для наблюдения за возможным появлением колоний медленно растущих дрожжей.

Отдельные изоляты (штаммы) получают путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же среды, на которые производили первичный посев, но без добавления специфических ингибиторов.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Чистой микробной культурой называют популяцию, представляющую собой потомство одного вида микроорганизма. Каждый новый изолят носит название штамма, которому присваивают буквенное или номерное обозначение.

Расами называют производственные штаммы одного вида дрожжей, различающихся между собой по степени проявления физиологической активности.

В генетических исследованиях пользуются так называемыми клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки. (Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Существуют прямые и непрямые методы получения чистых культур дрожжей. Первые основаны на выделении одной клетки или споры под непосредственным контролем через микроскоп. Во втором случае используют косвенные приемы для разделения клеток.

Капельный способ Линдера. Суспензию дрожжей разбавляют жидким суслом до концентрации ≈ 100 клеток в 1 мл и стерильным чертежным пером наносят мельчайшие капельки на необезжиренное покровное стекло, простерилизованное фламбированием в пламени газовой горелки. Капельки располагают в определенном порядке, обычно по пять капель в два ряда, т. е. всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над влажной камерой, которую запечатывают минеральной смазкой. Все капли немедленно просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по одной единственной клетке. Если все капли содержат по нескольку клеток, то увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют. После трех – четырехдневного инкубирования, когда отмеченные единичные клетки образуют микроколонии, последние переносят стерильной иглой или полоской стерильной фильтровальной бумаги в жидкую среду и размножают.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Метод Линдера в видоизменении Надсона. Чистое покровное стекло проводят трижды через пламя горелки и края его обводят мастикой (смесь равных частей парафина и вазелинового масла). На центральную часть стекла наносят полоску прозрачной среды ч 10% желатины или 0,5 агара. В теплую и еще не застывшую среду вносят иглой суспензию дрожжей такого разведения, чтобы в каплю попало всего несколько клеток. Стекло помещают во влажную камеру и рассматривают препарат при малом увеличении микроскопа. (Булгаков Н.И.).

Находят ориентиры, которыми могут быть частички взвеси, пузырьки воздуха или дефекты стекла, и вычерчивают карту с расположенными по отношению к ориентирам одиночными клетками дрожжей. Через каждые 10-20 ч препарат повторно исследуют, зарисовывая все изменения. Когда отмеченные клетки разрастаются в микроколонии, покровное стекло перевертывают на предметное и под контролем глаза при малом увеличении микроскопа переносят иглой материал в пробирки. ( Булгаков Н.И.).

Метод Линдера, упрощенный Вучковичем. Видоизменение Вучковичем метода Линдера сводится к тому, что капельки суспензии, содержащие 3-4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно захватывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверхность плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных клеток в отмеченной капельке.

Из этих колоний пересевом выделяют чистые культуры. Таким способом можно сразу получить несколько одноклеточных культур за короткое время.

Выделение спор дрожжей при помощи микроманипулятора. К использованию микроманипулятора прибегают главным образом при необходимости изолировать споры из асков, так как вегетативные клетки легко повреждаются при микроманипулировании.

Аски разрывают либо механически прикосновением игл микроманипулятора, либо заранее обрабатывая суспензию препаратом ферментов (например, из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia), из лизирующих клеточную стенку дрожжей.

Для работы с микроманипулятором требуются специальные стеклянные микроиглы и влажные камеры. (Палагина Н. К.).

В эту группу включаются методы, основанные на разделении клеток в питательных средах и использовании специфических биологических особенностей отдельных видов для создания преимущественных условий для их роста.

Метод поверхностного посева на агаровые среды. Посевы производят либо из суспензии пипеткой, либо петлей по принципу «истощающего штриха».

Каплю суспензии, содержащей дрожжевые клетки наносят на поверхность застывшей подсохшей среды в чашке Петри. Стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют каплю по поверхности. Этим же шпателем можно еще засеять 2-3 чашки на случай, если в первой будет очень густой рост колоний. Процессы выделения чистой культуры заканчивается пересевом из отдельной, выросшей изолированно колонии в пробирку. Контролем чистоты выделенной культуры служит однородность клеток под микроскопом и однотипность колоний на чашке при последующем рассеве.

Метод рассева на поверхности агаровых сред можно применять как при работе с уже имеющимися культурами при проверке их чистоты, так и при первичном выделении дрожжей из любого субстрата. С целью повышения возможностей избирательного выделения культур дрожжей определенного вида, для рассева используют селективные среды, а при культивировании создают особые температурные условия. (Попова Т.Е., Попова Е.В.).

Для выделения дрожжей родов Brettanomyces и Lipomyces используют их устойчивость к антибиотику актиноиду, добавление которого в среду в концентрации 100-200 мг/л подавляет рост большинства видов других дрожжей.

Выделение чистых культур баллистоспоровых дрожжей. Баллистоспоровые дрожжи легко получить в чистой культуре, используя их способность отбрасывать споры на значительное расстояние. Если после посева на поверхность агаровой среды налить расплавленный агар в крышку чашки Петри и инкубировать ее в перевернутом положении, то через некоторое время на нижней пластинке появятся колонии в результате прорастания отстрелявшихся баллистоспор.

Поддержание и хранение чистых культур дрожжей

Длительное поддержание чистых культур микроорганизмов необходимо как при проведении научно-исследовательских работ, так и в производстве и при хранении в коллекциях.

Из-за различий биологических свойств видов невозможно использовать с равноценными положительными результатами один общий способ хранения для разных культур дрожжей. Большой опыт по хранению культур микроорганизмов, в том числе и дрожжей, накоплен сотрудниками крупных национальных коллекций, в которых имеется возможность проверять и оценивать разные методы хранения применительно к широкому набору дрожжевых организмов.

Наиболее широко применяемый способ – это поддержание культур путем их периодических пересевов. В последние два десятилетия получили распространение также методы хранения микробных культур под минеральным маслом и лиофильная сушка. Так как эти три метода применяются уже много лет, то имеется возможность сравнительной оценки их пригодности для хранения разных видов дрожжей. Другие, менее широко используемые или недавно разработанные методы можно рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур, которые поддерживаются обычными способами. (Семихатова Н. М., Белова М. Ф., Лозенко Л. Д.).

Периодические пересевы

Обычно культуры поддерживают, пересевая их на агаровых средах в двойной повторности. Одна пробирка, которую после засева совсем не открывают, служит контрольной, а из второй по мере надобности делают отсевы.

Частота пересевов. Сроки пересевов определяют для большинства культур дрожжей скоростью высыхания среды. Она зависит от температуры и влажности помещения, где хранят пробирки. В голландской коллекции*, насчитывающей более 6000 штаммов дрожжей, культуры хранят в специально предназначенных для этих целей, в постоянно проветриваемой комнате, где температура поддерживается зимой 18°С, а летом 20°С. Частота пересевов при этих условиях – каждые 5-7мес или пять раз в два года для основной массы культур и более частые для немногих других: например, ежемесячные для Schizosaccharomices japonicas и каждые две недели для Cyniclomyces (=Saccharomycopsis) guttulata.

Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного закупоривания пробирок и снижения температуры хранения. Так использование пробирок с завинчивающимися металлическими крышками вместо обычных ватных пробок предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту сохраняемых культур. Применение вазелинового масла для снижения скорости высыхания культур так же имеет свои недостатки. Поэтому хорошо сделанные ватные пробки(их можно сверху заливать парафином) все же остается лучшим средством закрывания пробирок. Они обеспечивают достаточный газообмен, хорошо предохраняют от микробного загрязнения и легко изготавливаются при помощи специальных машин, которые просты и доступны для любой лаборатории. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Ватные пробки, однако, не предохраняют культуры от заражения их микофильными клещами (mites). Для профилактики используют следующий прием. Перед посевами или пересевами культур пробку слегка выдвигают из пробирки и наносят на нее каплю раствора содержащего 10г сулемы, 50мл глицерина, 500мл этилового спирта и 450 мл воды. Затем пробку вдвигают в пробирку и несколько раз проворачивают ее, чтобы смочить внутренние стенки пробирки. В раствор можно добавить какой-либо краситель, для контроля за равномерностью смачивания.

Температура. Если хранение ведется при температуре в пределах 15-20°С , то после пересева пробирки сразу же помещают в коллекционное помещение, за исключением тех культур, которые требуют для роста более высокой температуры. К последним относятся, например, такие виды, как Saccaharomyces castellii и Torulopsis lacctis-condensii которые инкубируют при 30°С, а Candida slooffii, Pityrosporum ovale, P. Pachydermatis, Torulopsis bovina, T. Pintolopesii и Saccharomyces telluris – при 37°С психрофильные дрожжи выращивают и хранят при 3-4°С в холодильнике. Это виды: Candida aquatic, C. curiosa, C. salmonicola и все представители рода Leucosporidium. При низкой температуре после появления хорошего роста можно хранить и все другие дрожжи, за исключением психрофобных видов, ассоциированных с теплокровными животными, и некоторых устойчивых к полиеновым антибиотикам мутантов.

Среды. Во многих лабораториях и коллекциях дрожжи поддерживают и хранят на сусло-агаре. Было показано, однако, что на этой сложной среде при длительном хранении происходит изменение физиологических свойств, характерных для вида, за счет адаптации или стабилизации мутантов. В связи с этим для хранения более пригодна среда следующего состава, (в %):

Глюкоза 4 дрожжевая вода

Пептон 0,5 рН 5,8-6,0

Дрожжевую воду готовят, автоклавируя при 121°С 15 мин суспензию дрожжей (200 г на 1 л водопроводной воды) с небольшим количеством яичного белка. После стерилизации еще горячую воду дважды фильтруют через бумажный фильтр. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Пивоваренные дрожжи лучше поддерживать на сусло-агаре или на среде следующего состава (в %): Сусло − 3; Дрожжевой экстракт − 3; Пептон 5; Глюкоза − 1; Агар − 2.

Лучше растут на сусле, чем на глюкозо-пептонной среде, базидомицетовые дрожжи, близкие к головневым грибам.

Липомицеты поддерживают на среде с солодовым и дрожжевыми экстрактами, на которой эти дрожжи лучше сохраняют спорообразующую способность(в г/л.): Глюкоза − 10; Пептон – 5; Сусловый агар – 3; Дрожжевой экстракт – 3 Агар – 20; Водопроводная вода, л – 1.

В некоторых коллекциях дрожжи поддерживают в жидких средах (сусло с дрожжевым автолизатом, пептоном и глюкозой) с пересевами через 4 мес.

Осмотолерантные дрожжи, например Saccaromyces (= Zygosaccaharomyces) rouxii, пересевают на среде с высоким осмотическим давлением, а именно: на сусло-агаре с 50% глюкозы.

Дрожжи родов Brettanomyces и Dekkera сильно подкисляют среду в процессе роста и быстро гибнут, поэтому для их культивирования добавляют в среду 2% СаСО₃ и делают пересевы через каждые 2 мес.

Существуют также другие способы хранения чистых культур дрожжевых микроорганизмов.

Хранение под минеральным маслом заливка агаровых культур минеральным маслом с целью задержать высыхание и тем самым увеличить сроки пересевов.

Лиофилизация − процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния.

Методы криогенного хранения − замораживание дрожжей производят при разных режимах, включая температуры от − 10 до − 196°С и различные скорости охлаждения.

Хранение на адсорбентах − в качестве адсорбентов используют почву, песок, коалин, селикагель, вату и фильтровальную бумагу. Этот способ хранения не имеет разработанной стандартной техники.( Семихатова Н. М., Малыгина М. В., Володина Т. И.).

Похожие работы

Технология производства пива

Скачать

148414

10

9

... повышенной температуре, несвоевременное шпунтование танков при дображивании, приготовление заторов из сильно растворенных солодов, отрицательно влияют на пенообразование. Раздел 3.Технологический расчет сырья для производства пива Наименование Условное обозначение Количество на 100 кг зернового сырья Объем сусла Vc 54,51583365 Горячее сусло Vгс 56,696467 Холодное сусло Vхс 53, ...

Основы пивоварения

Скачать

191879

8

0

... этих препаратов превосходит активность ферментов солода по осахаривающей способности в 3-4 раза, по разжижающей - в 8-10 раз, по декстринирующей - в 10-20, по протеолитической - в 15-20 раз. Опыт использования в пивоваренной промышленности МЭК свидетельствует о том, что создание широкого набора эффективных мультиэнзимных композиций способствует успешной переработке повышенных количеств ...

Технология пивоварения

Скачать

54083

4

0

... любого, кто украдет росток, чтобы его возделывали в другой стране.[11] Учитывая все вышесказанное, утверждать с полной уверенностью - так сказать, однозначно, кто именно и когда первым стал использовать в технологии пивоварения хмель, весьма затруднительно. Но это, впрочем, не так уж важно. Главное то, что в результате у пива появился тот "пивной" вкус, который мы хорошо знаем сегодня.[11] Что ...

Разработка отварочной технологии производства пива

Скачать

197135

36

3

... со 100 до 138°С остается неизменным. При дальнейшем повышении температуры (до 143°С) уровень аминокислот падает, что связано с усилением реакции меланоидинообразования. 2. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ   2.1 Описание технологии производства пива «Рецептура №1», «Рецептура №2» и «Рецептура №3» В технологической схеме производства пива можно выделить несколько этапов (приложение 1): подготовка воды ...