Оптимізація умов проведення фотометричних реакцій

2.5 Оптимізація умов проведення фотометричних реакцій

Як видно з пункту 2.4 вміст етанолу впливає на аналітичний сигнал, тобто на чутливість. Щоб не вносити похибку ми надалі усі розчини цукрів будемо робити на 40 % сортировці для обох реагентів

Оптимізація умов проведення фотометричних реакцій з антроновим реагентом:

Приливаючи повільно сортировку до розчину антрону не відбувалося розшарування розчинів, але реакція миттєво проходила, тому було прийнято рішення приливати сортировку швидко та ставити в киплячу баню за секундоміром з інтервалом 2 хв.

В три термостійкі пробірки на 50 см³ приливаемо по 5,0 см³ антрону. Піпеткою на 5 мл відбираємо сортировку без цукру, та приливаємо 2,5 см³ в 1 пробірку з антроном (нехай стікає вільно, тобто не потрібно вповільнювати швидкість приливання сортировки). В момент початку приливання починаємо відлік часу. Коли пройде 25 секунд зачиняємо пробкою та перемішуємо вміст пробірки, та за 30 секунд ставимо в киплячу баню. Це буде розчин порівняння.

Повторюємо ті ж самі операції з досліджуваним розчином, чітко витримуючи 2 хвилини. Робимо мінімум 2 паралельних розчини.

Витримуємо рівно 6 хвилин на киплячій водяній бані кожну пробірку (тобто в 6 хв 30 сек дістаємо першу пробірку), поміщяємо її в льодяну баню та інтенсивно перемішуємо 30 сек (на таймері буде 7 хв). Швидко переливаємо в кювету, та проводимо виміри оптичної густини. Тіж самі операції проводимо з наступними пробірками.

Оптимізація умов проведення фотометричних реакцій з пікриновою кислотою:

В пробірку на 25 см³ з пришліфованою пробкою вносили 6 см³ 0,5 %-го розчину гідроксиду натрію. Приливали 2,5 см³ аналізуємого розчину та 1 см³ 0,5 %-ного розчину пікринової кислоти.

Аналогічно готуємо холосту пробу.

Пробірки закривали пришліфованими пробками, їх вміст перемішували та поміщали в киплячу водяну баню на 5 хв. Потім вміст пробірок охолоджували до кімнатної температури на льодяній бані 30 секунд, та вимірювали оптичну густину на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 470 нм в кюветі робочою товщиною 5 мм; розчин порівняння – холоста проба в кюветі з тією ж довжиною хвилі.

Рис. 2.5.1 Спектр розчину порівняння

Зробивши аналіз холостого розчину на спектрофотометрі, ми вибрали довжину хвилі саме 470 нм, адже видно, що при цій довжині хвилі знаходиться максимум.

 

2.6 Чутливість реакцій до індивідуальних вуглеводів.

Усі градуювальні розчини готувалися однаково. Наважки кристалогідратів вуглеводів перераховувалися на безводний цукор. Розведення розчинів робили виходячи з того, щоб оптичні густини були в інтервалі від 0,025 до 1,5.

Спочатку будували стандартний розчин 5,000 г/дм³ цукру в 40% водно-спиртовому розчині: 1,0000 г цукру розчиняли у водно-спиртовому розчині, переносили в колбу 200 см³, термостатували 20 хв. при 20 °С, довесли до позначки термостатованим водно-спиртовим розчином.

В якості р-на порівняння використовували 40% водно-спиртовий розчин.

В мірні колби на 50 см³ відбирали 0; 2,0; 5,0; 7,5; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 50,0 см³ стандартного розчину, термостатувати 20 хв. при 20 °С, доводили до позначки термостатованим водно-спиртовим розчином. Концентрація в отриманих розчинах : 0; 0,2; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5,0 мг/см³ вуглеводу.

Спочатку розчини з концентрацією 0,0 та 0,2 мг/мл цукру розводимо в 50 разів. Для цього 2 мл розчину переносили у колбу на 50,0 см³, та термостатували 20 хв. при 20 °С, доводили до позначки термостатованим водно-спиртовим розчином. Проводили вимір оптичної густини з антроновим реагентом, як показано вище, і підбирали розведення так, щоб оптична густина була в межах 0,025-0,080. Після того, як визначили оптимальне розведення, теж саме проводили з іншими розчинами, і будували градуювальний графік.

Для побудови індивідуальних градуювальних графіків з пікриновою кислотою спочатку будували стандартний розчин 0,2000 г/дм³ вуглеводу в 40% водно-спиртовому розчині: 0,2000 г цукру розчинили у водно-спиртовому розчині, перенесли в колбу 200 см³, термостатували 20 хв. при 20 °С, доводили до позначки термостатованим водно-спиртовим розчином.

В мірні колби 50 см³ відбирали 0; 5,0; 10,0; 20,0; 25,0 стандартного розчину, термостатували 20 хв. при 20 °С, доводили до позначки термостатованим водно-спиртовим розчином. Концентрація в отриманих розчинах : 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5 мг/см³ цукру.

Результати досліджень наведено в наступних таблицях та графіках:

  Таблиця 2.6.1 Дані визначення сахарози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,2	2,5	50	0,048	0,048	0,01
0,2			0,048
0,5	2,5	50	0,108	0,108	0,025
0,5			0,107
0,75	2,5	50	0,148	0,148	0,0375
0,75			0,148
1,0	2,5	50	0,193	0,193	0,05
1,0			0,193
1,5	2,5	50	0,278	0,277	0,075
1,5			0,276
2,0	2,5	50	0,383	0,381	0,1
2,0			0,378
2,5	2,5	50	0,488	0,483	0,125
2,5			0,478
5,0	2,5	50	0,900	0,898	0,25
5,0			0,895

Рис. 2.6.1 Градуювальний графік вмісту сахарози з антроном

 

Таблиця 2.6.2 Дані визначення сахарози з пікриновою кислотою (інверсія)

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.100	2.5	0.25	0.002	0.003
					0.004
10	0.2	0.200	2.5	0.5	0.128	0.132
					0.135
20	0.4	0.400	2.5	1	0.420	0.419
					0.417
25	0.5	0.500	2.5	1.25	0.565	0.567
					0.568
50	1.0	1.000	2.5	2.5	1.292	1.291
					1.290

Рис. 2.6.2 Градуювальний графік вмісту сахарози з пікриновою кислотою

Таблиця 2.6.3 Дані визначення глюкози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	50	0,000	0	0
0,2	2,5	50	0,033	0,034	0,01
0,2			0,034
0,5	2,5	50	0,080	0,077	0,025
0,5			0,073
0,75	2,5	50	0,120	0,117	0,0375
0,75			0,113
1,0	2,5	50	0,153	0,154	0,05
1,0			0,154
1,5	2,5	50	0,230	0,231	0,075
1,5			0,231
2,0	2,5	50	0,310	0,309	0,1
2,0			0,308
2,5	2,5	50	0,375	0,378	0,125
2,5			0,380
5,0	2,5	50	0,731	0,732	0,25
5,0			0,733

Рис. 2.6.3 Градуювальний графік вмісту глюкози з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.4 Дані визначення глюкози з пікриновою кислотою

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.100	2.5	0.25	0.004	0.004
					0.003
10	0.2	0.200	2.5	0.5	0.125	0.125
					0.124
20	0.4	0.400	2.5	1	0.373	0.372
					0.371
25	0.5	0.500	2.5	1.25	0.534	0.534
					0.534

Рис. 2.6.4 Градуювальний графік вмісту глюкози з пікриновою кислотою   Таблиця 2.6.5 Дані визначення фруктози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	20	0,000	0	0
0,2	2,5	20	0,096	0,100	0,025
0,2			0,104
0,50	2,5	20	0,231	0,229	0,0625
0,50			0,227
0,75	2,5	20	0,360	0,357	0,09375
0,75			0,354
1,00	2,5	20	0,479	0,481	0,125
1,00			0,483
1,50	2,5	20	0,748	0,752	0,1875
1,50			0,755
2,00	2,5	20	1,010	1,006	0,25
2,00			1,002
2,50	2,5	20	1,400	1,394	0,3125
2,50			1,388
5,00	2,5	20	2,450	2,430	0,625
5,00			2,410

Рис. 2.6.5 Градуювальний графік вмісту фруктози з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.6 Дані визначення фруктози з пікриновою кислотою

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.0	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.1	2.5	0.25	0.008	0.009
					0.010
10	0.2	0.2	2.5	0.5	0.090	0.091
					0.092
20	0.4	0.4	2.5	1	0.337	0.336
					0.335
25	0.5	0.5	2.5	1.25	0.440	0.440
					0.440
50	1.0	1.0	2.5	2.5	1.010	1.008
					1.006

Рис. 2.6.6 Градуювальний графік вмісту фруктози з пікриновою кислотою

Таблиця 2.6.7 Дані визначення мальтози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	25	0,000	0	0
0,190	2,5	25	0,070	0,072	0,019
0,190			0,074
0,475	2,5	25	0,163	0,164	0,048
0,475			0,164
0,713	2,5	25	0,250	0,250	0,071
0,713			0,249
0,950	2,5	25	0,346	0,342	0,095
0,950			0,338
1,425	2,5	25	0,500	0,506	0,143
1,425			0,511
1,900	2,5	25	0,645	0,643	0,190
1,900			0,640
2,375	2,5	25	0,838	0,834	0,238
2,375			0,829
4,750	2,5	25	1,600	1,599	0,475
4,750			1,598

Рис. 2.6.7 Градуювальний графік вмісту мальтози з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.8 Дані визначення мальтози з пікриновою кислотою (інверсия)

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.100	2.5	0.25	0.000	0.000
					0.000
10	0.2	0.200	2.5	0.5	0.031	0.029
					0.027
20	0.4	0.400	2.5	1	0.301	0.300
					0.298
25	0.5	0.500	2.5	1.25	0.436	0.434
					0.431
50	1.0	1.000	2.5	2.5	1.111	1.110
					1.108

Рис. 2.6.8 Градуювальний графік вмісту мальтози з пікриновою кислотою

  Таблиця 2.6.9 Дані визначення арабінози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	1	0,000	0	0
0,2	2,5	1	0,210	0,213	0,5
0,2			0,216
0,5	2,5	1	0,582	0,586	1,25
0,5			0,590
0,75	2,5	1	0,900	0,900	1,875
0,75			0,900
0,2	2,5	5	0,028	0,029	0,1
0,2			0,030
0,5	2,5	5	0,088	0,090	0,25
0,5			0,092
0,75	2,5	5	0,170	0,167	0,375
0,75			0,163
1,00	2,5	5	0,200	0,203	0,5
1,00			0,205
1,50	2,5	5	0,338	0,332	0,75
1,50			0,325
2,00	2,5	5	0,467	0,461	1
2,00			0,455
2,50	2,5	5	0,600	0,598	1,25
2,50			0,595
5,00	2,5	5	1,195	1,197	2,5
5,00			1,198

Рис. 2.6.9 Градуювальний графік вмісту арабінози. З антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.10 Дані визначення арабіноза з пікриновою кислотою

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.050	2.5	0.125	0.022	0.022
					0.022
10	0.2	0.100	2.5	0.25	0.081	0.081
					0.081
20	0.4	0.200	2.5	0.5	0.261	0.261
					0.261
25	0.5	0.250	2.5	0.625	0.332	0.332
					0.332
50	1.0	0.500	2.5	1.25	0.791	0.790
					0.788

Рисю 2.6.10 градуювальний графік вмісту арабінози з пікриновою кислотою

Таблиця 2.6.11 Дані визначення лактози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	25	0,000	0	0
0,2000	2,5	25	0,060	0,060	0,02
0,2000			0,059
0,5000	2,5	25	0,155	0,158	0,05
0,5000			0,160
0,7500	2,5	25	0,225	0,223	0,075
0,7500			0,220
1,0000	2,5	25	0,292	0,294	0,1
1,0000			0,295
1,5000	2,5	25	0,442	0,440	0,15
1,5000			0,438
2,0000	2,5	25	0,580	0,582	0,2
2,0000			0,583
2,5000	2,5	25	0,706	0,711	0,25
2,5000			0,715
5,0000	2,5	25	1,401	1,392	0,5
5,0000			1,382

Рис. 2.6.11 Градуювальний графік вмісту лактози з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.12 Дані визначення лактози з пикриновою кислотою

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.050	2.5	0.125	0.022	0.022
					0.022
10	0.2	0.100	2.5	0.25	0.081	0.081
					0.081
20	0.4	0.200	2.5	0.5	0.261	0.261
					0.261
25	0.5	0.250	2.5	0.625	0.332	0.332
					0.332
50	1.0	0.500	2.5	1.25	0.791	0.790
					0.788

Рис. 2.6.11 Градуювальний графік вмісту лактози з пікриновою кислотою

Таблиця 2.6.12 Дані визначення галактози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0.0	2.5	50	0.000	0	0
0.2000	2.5	50	0.021	0.020	0.01
0.2000			0.018
0.5000	2.5	50	0.046	0.047	0.025
0.5000			0.047
0.7500	2.5	50	0.074	0.074	0.0375
0.7500			0.073
1.0000	2.5	50	0.100	0.101	0.05
1.0000			0.102
1.5000	2.5	50	0.158	0.159	0.075
1.5000			0.160
2.0000	2.5	50	0.210	0.212	0.1
2.0000			0.213
2.5000	2.5	50	0.268	0.269	0.125
2.5000			0.270
5.0000	2.5	50	0.529	0.531	0.25
5.0000			0.533

Рис. 2.6.12 Градуювальний графік вмісту галактози з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.13 Дані визначення галаткози з пікриновою кислотою

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.0	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.1	2.5	0.25	0.005	0.004
					0.003
10	0.2	0.2	2.5	0.5	0.080	0.081
					0.082
20	0.4	0.4	2.5	1	0.324	0.322
					0.320
25	0.5	0.5	2.5	1.25	0.440	0.440
					0.440
50	1.0	1.0	2.5	2.5	1.021	1.020
					1.018

Рис. 2.6.13 Градуювальний графік вмісту галактози з пікриновою кислотою

 

Таблиця 2.6.14 Дані визначення рафінози з антроновим реагентом

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0,0	2,5	50	0,000	0	0
0,2000	2,5	50	0,028	0,027	0,01
0,2000			0,026
0,5000	2,5	50	0,075	0,075	0,025
0,5000			0,074
0,7500	2,5	50	0,100	0,100	0,0375
0,7500			0,100
1,0000	2,5	50	0,132	0,130	0,05
1,0000			0,128
1,5000	2,5	50	0,212	0,216	0,075
1,5000			0,219
2,0000	2,5	50	0,288	0,284	0,1
2,0000			0,280
2,5000	2,5	50	0,399	0,402	0,125
2,5000			0,405
5,0000	2,5	50	0,778	0,774	0,25
5,0000			0,770

Рис. 2.6.14 Градуювальний графік з рафінози з антроновим реагентом

Таблиця 2.6.15 Дані визначення рафінози з пікриновою кислотою (інверсія)

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0.0	0.000	2.5	0	0.000	0
5	0.1	0.100	2.5	0.25	0.001	0.001
					0.000
10	0.2	0.200	2.5	0.5	0.025	0.027
					0.029
20	0.4	0.400	2.5	1	0.286	0.284
					0.281
25	0.5	0.500	2.5	1.25	0.417	0.414
					0.411
50	1.0	1.000	2.5	2.5	1.076	1.074
					1.071

Рис. 2.6.15 Градуювальний графік вмісту рафінози з пікриновою кислотою

 

Таблиця 2.6.16 Дані визначення алкософту з антроновим реагентом.

Концентрація, мг/см3	Аліквота, см3	Розведення	Оптична густина	Середня оптична густина	Кількість цукру в реакційній суміші, мг
0.0	2.5	50	0.000	0	0
0.2000	2.5	50	0.015	0.013	0.01
0.2000			0.011
0.5000	2.5	50	0.028	0.031	0.025
0.5000			0.033
0.7500	2.5	50	0.050	0.052	0.0375
0.7500			0.053
1.0000	2.5	50	0.077	0.079	0.05
1.0000			0.080
1.5000	2.5	50	0.130	0.126	0.075
1.5000			0.121
2.0000	2.5	50	0.160	0.159	0.1
2.0000			0.158
2.5000	2.5	50	0.196	0.198	0.125
2.5000			0.200
5.0000	2.5	50	0.419	0.420	0.25
5.0000			0.421

Рис. 2.6.16 Градуювальний графік вмісту алкософту з антроновим реагентом

 

Таблиця 2.6.17 Дані визначення алкософту з пікриновою кислотою (інверсія)

 

Аліквота стандартного р-ну в колбу на 50 мл, мл	Концентрація робочого р-ну, мг/см3	Конентрація градуювального р-ну, мг/см3	Аліквота Градуювального р-ну, см3	Кількість цукру в реакційній суміші, мг	Оптична густина	Середня оптична густина
0	0,0	0,000	2,5	0	0,000	0
5	0,1	0,100	2,5	0,25	0,000	0,000
					0,000
10	0,2	0,200	2,5	0,5	0,001	0,001
					0,000
20	0,4	0,400	2,5	1	0,142	0,140
					0,137
25	0,5	0,500	2,5	1,25	0,213	0,210
					0,207
50	1,0	1,000	2,5	2,5	0,563	0,561
					0,558

Рис. 2.6.17 Градуювальний графік вмісту алкософту з пікриновою кислотою

З наведених даних видно, що чутливість визначення вуглеводів з антроновим реагентом в 30-50 разів вища, ніж чутливість визначення відповідних вуглеводів з пікриновою кислотою.

Усі результати пунтку 2.6 звели в таблицю 2.7.1.