Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл
Монослой клеток фиксируют при помощи обычных фиксаторов и окрашивают генциан-виолетом или метиленовым сидим
Анализ структурных вирусных полипептидов
Вирус кошачьего сомика
Герпесвирус саймири
Навигация
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
39017
знаков
3
таблицы
15
изображений
Курсовая работа
на тему:
"Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов"
Введение
В группу герпесвирусов входят, вероятно, более 70 вирусов, имеющих широкий круг хозяев. Характеристика и классификация вирусов этой труппы детально рассмотрены Мэтьюсом. Герпесвирусы подразделяют на три подсемейства: α-герпесвирусы; β-герпесвирусы; γ-герпесвирусы. Разделение на подсемейства основано на нескольких критериях, в частности на характере репликации вирусов, круге хозяев, белковом составе и структуре генома.
В этой работе мы обсудим культивирование, очистку и титрование герпесвирусов, взяв в качестве примера по одному представителю каждого из подсемейств, указанных выше. Особое внимание, однако, будет уделено вирусам простого герпеса – наиболее интенсивно изучаемым вирусам этой группы. Будут рассмотрены цитометаловирус человека и герпесвирус саймири.
1. Вирусы простого герпеса типов 1 и 2
Эти два вируса входят в а-подгруппу герпесвирусов. Они вызывают разнообразные заболевания человека, такие, как воспаление десен, стоматит, менингит, энцефалит и венерическую форму воспаления гениталий. Эти вирусы вызывают заболевания в ослабленных организмах. Некоторые факты указывают на связь вируса простого герпеса типа 2 с раком шейки матки, а вируса простого герпеса типа 1 с некоторыми другими злокачественными новообразованиями. Именно поэтому данным герпесвирусам, в особенности последние 10 лет, уделяют пристальное внимание. За последнее время были разработаны высокоэффективные методы наращивания, очистки и титрования этих вирусов. Методы изучения ВПГ-1 – и ВПГ-2 сходны между собой.
1.1 Получение заготовок вируса
1.1.1 Клетки
Широкий круг хозяев ВПГ-1 и ВПГ-2 позволяет получать заготовки вирусов на различных клетках. Тем не менее, выбор чувствительной культуры не прост из-за того, что выход вирусов в различных клеточных линиях широко варьирует. На практике для получения заготовок вируса часто используют клетки линии Нер-2 или ВПК с КЗ. Работы, проведенные с ВПГ-1 и ВПГ-2 в нашей лаборатории, показывают, что выход различных штаммов отличается примерно в 10 раз для данных клеточных линий. Хотя из этих двух линий клетки ВНК менее требовательны к условиям культивирования, клетки обеих линий достигают высокой плотности в роллерных сосудах как из стекла Winchester, так и из пластика. В сосудах такого большого объема особенно важно поддерживать оптимальный рН. При использовании бикарбонатного буфера культуральную среду необходимо насыщать С02 еще до стерилизации. В противном случае клетки следует выращивать в атмосфере с высоким содержанием С02. Аппаратуру для одновременного культивирования большого количества роллерных сосудов можно купить или изготовить в мастерских. Например, на рис. l'O.l сфотографирован аппарат, изготовленный из рамы Dexion, колес Meccano и моторов Parvalux в тропическом исполнении.
Клетки указанных выше линий способны расти в различных питательных средах. Обычно мы используем автоклавируемую среду Игла в модификации Глазго с 10% ТС. Для клеток линии ВНК в среду следует добавить 10% триптозофосфатного бульона. Окончательный выбор клеточной линии зависит от ряда факторов, в частности от характера эксперимента. Естественно, что используемые для приготовления вирусных заготовок клеточные линии должны быть предварительно проверены на отсутствие микоплазмы.
1.1.2 Методы заражения
Основной метод заражения описан Ватсоном и др. Целесообразно перед началом работы получить первичную и вторичную заготовки вируса, которые по возможности следует разместить в нескольких холодильниках на –70°С. Как правило, рабочие заготовки получают из вторичных и таким образом исключают длительное пассирование вируса. При этом сводится к минимуму возможность получения вирусных заготовок, сильно отличающихся по номеру пассажа, что создает трудности в прямом сравнении данных, полученных в разных экспериментах. В большинстве случаев для получения вирусных заготовок мы используем роллерные культуры, почти достигшие монослоя. Во флаконах обычно содержится 5–108 клеток ВНК или 3-108 клеток Нер-2. Высокая концентрация клеток позволяет получить и высокий титр вирусной заготовки. Клеточный монослой промывают для удаления слабо прикрепленных клеток и затем из вторичной заготовки вносят разведенный вирус. Чаще всего мы предпочитаем заражать клетки при множественности инфекции 0,001–0,01 БОЕ/кл, что предотвращает накопление дефектных вирионов.
1.1.3 Наращивание вируса
Любая стандартная среда для культивирования клеток может быть использована для получения вирусных заготовок. Обычно для выращивания клеток мы используем среду с 10% ТС. Уменьшение концентрации сыворотки приводит к некоторому снижению выхода вируса, однако при этом экономится дорогостоящая сыворотка. Заготовки вируса получают, используя следующую методику:
Похожие работы
... , жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах. Микробиологические методы Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур ...
... фагами, либо путем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельных вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом освобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких вирусов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем ...
... часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей ...
... через 13, перманганат калия 1 : 1000 через 10 мин. Микроб очень чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, в меньшей степени — к пенициллину и синтомицину, устойчив к мицелину и колимицину. Эпизоотология. В естественных условиях болеют овцы независимо от возраста, пола и породности. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши, менее восприимчивы морские свинки, голуби. ...
0 комментариев