Вирус кошачьего сомика

1.6.4 Вирус кошачьего сомика

Данный вирус имеет ограниченный круг хозяев и лучше всего размножается в клетках американского сомика-кошки. Методы культивирования и очистки этого вируса такие же, как и для ВПГ-1, за исключением того, что ВВ-клетки и вирус культивируют при 28°С.

2. Цитомегаловирус человека

Р-субгруппа герпесвирусов включает в себя цитомегаловирусы различных животных. Цитомегаловирусы человека вызывают различные заболевания, особенно у людей с ослабленной иммунной системой, а также в период беременности. Инфекция этими вирусами довольно часто приводит к смертельному исходу либо вызывает сильнейшее истощение больных с естественной или искусственной иммунной супрессией. Во время беременности этот вирус может вызвать уродства плода, выкидыши и повышенную чувствительность новорожденных к тяжелым инфекциям после родов. Именно по этим причинам в последние 10 лет резко возросла интенсивность изучения цитомегаловируса. Тем не менее, в этой области в отличие от вирусов простого герпеса не достигнуто значительного прогресса.

2.1 Получение заготовок вируса

Репликативный цикл цитомегаловируса человека продолжительнее, чем штаммов ВПГ. Кроме того, данный вирус прочно ассоциирован с клеткой и имеет высокую клеточную специфичность. Хотя во многих лабораториях для наращивания этого вируса используют клетки MRC-5, Flow 5000 или Нер-2, В. Гибсон рекомендует ранние пассажи на фибробластах крайней плоти человека или клетках легкого эмбриона человека. Гибсон культивирует перечисленные клетки в среде DMEM, содержащей 4500 мг/л глюкозы и 10% ЭТС. В нашей лаборатории используют клетки MRC-5, культивируемые в среде Игла в модификации Glasgow с 10% ЭТС. Заготовки вируса получают следующим образом:

1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, добавляют CMV в минимальном объеме среды. Адсорбцию вируса проводят 1–2 ч при 37°С.

2. После адсорбции к клеткам добавляют необходимый объем культуральной среды и инкубируют их при 37°С.

3. Через 7–10 дней после заражения старую культуральную среду заменяют на свежую. Клетки продолжают инкубировать при 37°С до выявления признаков ЦПД.

4. Культуры ежедневно просматривают. Когда ЦПД достигнет своего максимума, клетки собирают в культуральную среду и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Собирают супернатант.

5. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С.

6. Большая часть вируса содержится в культуральной среде, поэтому супернатант, полученный на стадии 4, центрифугируют 2 ч при 12000 об/мин в роторе GSA.

7. Полученный осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, осторожно разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С. Данный вирус не так стабилен при –70°С, как ВПГ. Поэтому его не следует подвергать частым замораживаниям и оттаиваниям. Оттаивание CMV, как и ВПГ, следует проводить быстро в теплой воде.

2.2 Цикл размножения

Смит и Де Харвен сравнили кривые роста ВПГ и CMV и определили время наступления тех или иных фаз инфекции. Результаты этих исследований приведены на рис. 8 и в табл. 2. Однако остается непонятным, насколько точно отражают данные кривые последовательность событий в зараженной клетке. Как уже отмечалось выше, цикл размножения CMV значительно длиннее, чем ВПГ.

Таблица 2. Время наступления основных этапов инфекции CMV и ВПГ. Сравнительные данные, полученные при помощи электронной микроскопии

2.3 Идентификация вируса

Множество попыток было предпринято для разработки удобных методов титрования медленно растущих вирусов. В большинстве лабораторий остановились на методе определения конечной точки TCID₅₀. Сложность данной проблемы заключается в сохранении клеточного монослоя в течение времени, необходимого для формирования бляшек. В нашей лаборатории используют следующую модификацию метода бляшек, рекомендованную Вентвесом и Френчем:

1. Клетки линии MRC-5 высевают в 24-луночные планшеты или в чашки Петри диаметром 30 мм для культивирования клеток. Культуры, достигшие состояния монослоя, инфицируют вирусом, разведенным в 200 мкл культуральной среды.

2. По истечении первого часа адсорбции среду заменяют на 1%-ную агарозу, приготовленную на культуральной среде с 2% ЭТС. Клетки инкубируют при 37°С.

3. Через неделю еще раз добавляют необходимое количество агарозы и продолжают инкубацию при 37°С.

4. Через 2–3 нед с момента заражения под микроскопом удается обнаружить небольшие очаги инфицированных клеток. Незадолго до того, как разрушится монослой неинфицированных клеток, культуры фиксируют в забуференном формалине, осторожно удаляют агарозу и окрашивают 1%-ным генцианвиолетом. Небольшие очаги инфекции можно подсчитать под стереомикроскопом. Вместо генцианвиолета культуры можно окрашивать 1%-ным нейтральным красным. Кроме того, нам удалось получить бляшки CMV, используя КМЦ вместо агарозы.

2.4 Метод черных бляшек

Этот метод может быть использован для идентификации любых вирусов. Однако особенно удобен он оказался для CMV, образующего бляшки малого размера.

1. Культуры, достигшие монослоя, инфицируют обычным способом.

2. Через 6–7 дней после заражения удаляют КМЦ и клетки трижды промывают PBS. Затем в течение 5 мин клетки фиксируют 0,25%-ным раствором глутарового альдегида в PBS.

3. Отмыв фиксатор с помощью PBS, добавляют соответственно разведенную антисыворотку или моноклональные антитела против CMV. Клетки оставляют при комнатной температуре на 2 ч.

4. Клетки отмывают от антител PBS и инкубируют 3 ч при комнатной температуре со вторыми, обычно конъюгированными с пероксидазой хрена антителами против первых антител.

5. После трехкратной промывки в PBS в каждую культуру добавляют субстрат Hanker-Yates, 50 мл 0,1 M трис-HCl, pH 7,5, и 0,5 мл 1%-ной H₂0₂). Окраска проявляется в течение 5–30 мин.

6. Чашки промывают дистиллированной водой, переворачивают и дают им высохнуть в темноте. Темноокрашенные бляшки вируса идентифицируют и подсчитывают.

2.5 Культивирование и очистка CMV

1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, культуры заражают вирусом.

2. По окончании адсорбции культуральную среду заменяют свежей, содержащей 2% ЭТС. Инфицированные клетки культивируют при 37°С.

3. При необходимости через 48 ч после заражения культуральную среду заменяют средой, содержащей радиоактивную метку. Например, средой с 2% ЭТС и 1 мкКи/мл – метионина или же средой с 2% ЭТС и 2 мкКи/мл – аминокислот.

4. Первые признаки ЦПД проявляются через 3 дня после инфекции. Затем ЦПД становится более явным, и на 7–10 день после инфекции клетки открепляются от субстрата. Вирус следует собирать именно на этой стадии. Для получения нуклеокапсидов клетки собирают несколько раньше.

Обычно для иммунологических исследований или иммунизации животных мы выделяем CMV из культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для анализа спектров вирусных белков и т.д. специалисты рекомендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который приводится ниже. Исходным материалом для получения вирусных препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чистоты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой инфекционности препарата и целостности вирусных частиц следует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиенте плотности, предложенное Барзилаи и др. для выделения CMV, было применено Тэлботом и Алмейдиа. Метод надежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют следующим образом:

1. Клетки собирают в культуральную среду, центрифугируют 10 мин при 1500 g и 4°С, затем наслаивают 3 мл супернатанта на 9 мл градиента 30% глицерина – 35% тартрата. Градиенты готовят согласно.

2. Градиент центрифугируют 20 мин при 40000 об/мин и 4°С в роторе SW41. После центрифугирования по светорассеянию, как правило, обнаруживают три фракции: неинфекционные оболочечные частицы, вирионы и плотные частицы. Вирусные частицы каждой фракции могут быть суспендированы в буфере и при необходимости повторно очищены в таком же градиенте.

Гибсон предлагает ряд модификаций этого метода, которые успешно применяются в его лаборатории.

1. Градиенты общим объемом 18 мл готовят в 38-мл пробирках для ротора SW27. На градиент наслаивают 20 мл осветленной культуральной среды и центрифугируют 40 мин при 25000 об/мин и 4°С в роторе SW27.

2. При необходимости обычно используемый буфер трис-НС1 заменяют на 0,04 М фосфатный буфер, рН 7,4.

3. Заменяют тартрат калия на тартрат натрия, если соль калия мешает последующему анализу. Натриевая соль менее растворима при 4°С, чем калиевая.

4. При необходимости вместо тартрата можно использовать градиенты сахарозы. Условия центрифугирования те же.

2.6 Типы частиц CMV

На рис. 10 представлены электронные микрофотографии частиц CMV различной морфологии, полученные методом негативного контрастирования. Спектры структурных полипептидов этих частиц, полученные электрофорезом в полиакриламидном геле, показаны на рис. 11.

2.6.1 Неинфекционные оболочечные частицы

Аймайер и Гибсон провели детальный анализ характерных признаков данных частиц. Несмотря на их сходство по внешнему виду и белковому составу со стандартными вирионами, они не содержат ДНК и, следовательно, неинфекционны.

2.6.2 Частицы высокой плотности

Структура и состав подобных частиц проще, чем неинфекционных оболочечных и стандартных вирионов. Эти частицы представляют собой большие плотные сферы, заполненные гомогенным материалом и окруженные внешней мембраной. Они не содержат ДНК., и 90% всего их белка приходится на матриксный белок, имеющий мол. массу 69 кД.

2.6.3 Вирионы

Гибсон опубликовал подробные спектры структурных белков многих штаммов CMV человека и сравнил их с CMV обезьян. Эти данные представлены на рис. 12 и в табл. 3.

Похожие работы

Методы микробиологической диагностики

Скачать

84581

10

15

... , жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах. Микробиологические методы Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт нали­чия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур ...

Являются ли вирусы живыми организмами

Скачать

122993

0

0

... фагами, либо путем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельных вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом освобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких вирусов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем ...

ПЦР–диагностика

Скачать

49933

0

0

... часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей ...

Эпизоотология

Скачать

251187

1

0

... через 13, перманганат калия 1 : 1000 через 10 мин. Микроб очень чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, в меньшей степени — к пенициллину и синтомицину, устойчив к мицелину и колимицину. Эпизоотология. В естественных условиях болеют овцы незави­симо от возраста, пола и породности. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши, менее восприимчивы морские свинки, голуби. ...