Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл
Монослой клеток фиксируют при помощи обычных фиксаторов и окрашивают генциан-виолетом или метиленовым сидим
Анализ структурных вирусных полипептидов
Вирус кошачьего сомика
Герпесвирус саймири
Навигация
Анализ структурных вирусных полипептидов
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
39017
знаков
3
таблицы
15
изображений
1.5.3 Анализ структурных вирусных полипептидов
В большинстве случаев проводится электрофорез в пластинах полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Na, как было описано впервые Даймэком и Ватсоном. Модификация данного метода изложена в работе. Гели окрашивают кумасси бриллиантовым синим, а для авторадиографического анализа экспонируют с рентгеновской пленкой. На рис. 6 представлены спектры структурных полипептидов ВПГ-1 и ВПГ-2, полученные гель-электрофорезом. Другие характеристики этих полипептидов приведены в табл. 1.
Таблица 1. Свойства и номенклатура некоторых белков ВПГ-1 и ВПГ-2
| ВПГ-2 | Свойства | ВПГ-1 | ||||
| номер белка | структурный вирусный белок | молекулярная масса | молекулярная масса | структурный вирусный белок | номер белка | |
| ICSP 5–8 ICSP 9 ICSP 10 ICSP 11 ICSP 12 ICSP 13–15 ICSP 22 NN ISP 34–35 NN NN ICSP 46–47 | NS VP5 NS NS VP7–8,5 NS NN NS NS NN VP22–23 | 182–186 157 153 146 143 126–140 85–90 92 54 42 4 53 28–30 | Предранний фос-фопротеин Основной белок капсида Рибонуклеотидре-дуктаза Основной ДНК-связывающий белок Гликопротеины gA, gB Щелочная нуклеа-за Гликопротеин gE Белок, ассоциированный с ДНК-полимеразой Тимидинкиназа Гликопротеин gD, ответственный за перекрестную нейтрализацию между ВПГ-2 и ВПГ-1 Белок капсида | 175 155 149 132 112–126 85–90 80 48 44 59 30–33 | NS VP5 NS NS VP7–8,5 NS NN NS NS VP18 VP22–23 | ICP 4 ICP 5 ICP 6 ICP 8 ICP 9–14 ICP 19 NN ICP 29 NN ICP 31 ICP J39–40 |
1.6 Другие а-герпесвирусы
В нашей лаборатории выращены и очищены и многие другие а-герпесвирусы, включая: вирус мамиллита крупного рогатого скота; вирус псевдобешенства; вирус герпеса лошадей типа 1; вирус ринотрахеита кошек; вирус кошачьего сомика. С этими вирусами работают практически так же, как и с вирусами простого герпеса. Поэтому ниже мы отметим только особенности работы с каждым из перечисленных выше вирусов.
1.6.1 Вирус мамиллита крупного рогатого скота и вирус псевдобешенства
Эти вирусы дают на клетках ВНК высокие титры, которые легко определить суспензионным методом, предложенным Расселом. Для очистки вирусов клетки ВНК заражают с высокой множественностью инфекции и культивируют при 37°С 24 ч или 48 ч. На этой стадии вирусы могут быть очищены. Таким образом, получают качественные препараты оболочечных вирусов, белковый спектр которых представлен на рис. 7.
1.6.2 Вирус герпеса лошадей типа 1
Рестрикционный анализ показывает, что разные штаммы EHV-1 могут принадлежать как субтипу 1, так и субтипу 2. Первый связан с выкидышами у кобыл, хотя выделяют его и из респираторного тракта. Второй относится к вирусам "респираторного типа" и не связан с выкидышами. Вирусы субтипа 1 размножаются во многих культурах. В нашей лаборатории мы обычно используем клетки линии RK13, хотя в других лабораториях предпочитают использовать клетки лошадей. Кроме того, вирусы субтипа 1 успешно размножаются в культурах клеток L-M. Некоторые штаммы субтипа 1 были адаптированы к росту на хомяках. Вирусные изоляты субтипа 2 растут только в клетках лошадей. Используя метод 1, можно проводить очистку вирусов обоих субтипов. На рис. 7 показаны спектры полипептидов EHV-1, BMV, PRV, ВПГ-1 и ВПГ-2.
1.6.3 Вирус ринотрахеита кошек
Этот вирус специфичен для клеток кошачьего происхождения. Культивируют его так же, как и ВПГ-1. Для наращивания вируса мы используем, как правило, линию клеток кошки, представленную д-ром П. Тэлботом, однако можно использовать эмбриональные клетки легкого кошки, полученные доктором О. Джэр-ретом и поставляемые фирмой Flow Laboratories, Irvine, Scotland. Доктор P. Мэйес в градиенте тартрата калия успешно выделил вирус из культуральной среды инфицированных клеток почки кошек Crandell-Rees.
Похожие работы
... , жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах. Микробиологические методы Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур ...
... фагами, либо путем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельных вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом освобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких вирусов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем ...
... часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей ...
... через 13, перманганат калия 1 : 1000 через 10 мин. Микроб очень чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, в меньшей степени — к пенициллину и синтомицину, устойчив к мицелину и колимицину. Эпизоотология. В естественных условиях болеют овцы независимо от возраста, пола и породности. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши, менее восприимчивы морские свинки, голуби. ...
0 комментариев