Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл
Монослой клеток фиксируют при помощи обычных фиксаторов и окрашивают генциан-виолетом или метиленовым сидим
Анализ структурных вирусных полипептидов
Вирус кошачьего сомика
Герпесвирус саймири
Навигация
Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
39017
знаков
3
таблицы
15
изображений
1. Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл.
2. Добавляют необходимое количество среды для культивирования клеток.
3. Клетки инкубируют 2–3 дня при соответствующей температуре. Однако продолжительное наращивание вируса при низкой температуре может привести к получению материала, содержащего большой процент температур-но-чувствительных мутантов или по крайней мере вируса, лучше растущего при 32°С, чем при 37°С. По этой причине мы предпочитаем инкубацию при 37°С.
4. Через 2 дня инкубации при 37°С начинают появляться признаки ЦПД, однако сроки их появления могут варьировать в зависимости от штамма вируса и линии клеток. Как правило, ВПГ-2 размножается заметно быстрее, чем ВПГ-1. Как известно, существует два вида ЦПД: синцитиальное и несинцитиальное. Морфологическая картина ЦПД, вызванного этими двумя штаммами, показана на рис. 2.
5. Клетки собирают после максимального проявления признаков ЦПД. Методика сбора клеток зависит от штамма вируса и линии клеток. Так, в случае штамма HFEM и клеток линии ВНК основную массу среды можно удалить из культурального сосуда без потери вируса. Затем клетки собирают в оставшуюся среду стерильной резиновой палочкой и центрифугируют при малой скорости. При работе с другими штаммами вируса, например штаммом 186, инфицированные клетки удается собрать только центрифугированием культуральной среды, поскольку большая часть клеток отрывается от поверхности сосуда. Если лизис клеток уже произошел, необходимо использовать среду как составную часть заготовки вируса. Клетки собирают центрифугированием, а затем ресуспендируют в выбранной среде, например стерильной дистиллированной воде или же обычной культуральной среде. Заготовки можно ресуспендировать в среде с криопротектором, хотя это и не является строго обязательным.
6. Одной из серьезных проблем, возникающих по мере получения заготовок вирусов герпеса, является их очистка от клеточного материала, поскольку большая часть вируса тесно связана с клетками. Клетки разрушают, проводя ряд циклов замораживания и оттаивания, однако это может привести и к снижению титра вируса. Обработка клеток ультразвуком небезопасна из-за возможного образования аэрозолей, содержащих инфекционный вирус. Поэтому лучше всего проводить дезинтеграцию в ультразвуковой бане в закрытом сосуде. К сожалению, мы не можем рекомендовать какую-либо определенную марку ультразвукового дезинтегратора. Необходимо проверять эффективность каждого из них. Вирусные заготовки обрабатывают ультразвуком до полного разрушения клеток. Процедуру проводят в ледяной воде, чтобы не допустить сильного нагревания.
7. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, готовые заготовки разливают в ампулы и хранят, как описано ниже. Заготовки вируса герпеса длительное время лучше всего хранить при –70°С. Ни при каких обстоятельствах не следует хранить вирусы герпеса при –20°С, поскольку это приводит к значительному снижению инфекционного титра. В течение нескольких дней штамм HFEM можно хранить при 4°С, однако этот срок варьирует для разных штаммов. Оттаивание вируса необходимо проводить быстро, по возможности следует избегать повторного замораживания и оттаивания. Тем не менее, мы показали, что штамм HFEM, имеющий высокий титр в культуральной среде, теряет всего лишь 0,51og инфекционного титра при пятикратном замораживании и оттаивании. Мы обнаружили, что и при быстром оттаивании вирусных заготовок, хранящихся при –70°С даже в течение 5 лет, не происходит снижения титра вируса. Перед использованием каждую заготовку необходимо проверить на стерильность как на твердой, так и в обогащенной жидкой бактериальных средах. Лучше всего проверять заготовки под электронным микроскопом, чтобы исключить использование тех заготовок, в которых велико соотношение физических и инфекционных частиц. Мы установили, что с помощью описанных выше методов удается получать заготовки с титрами около 109–1010 БОЕ/мл и низкими соотношениями физических и инфекционных частиц.
1.2 Электронная микроскопия
Подсчет частиц по методу "1 оор drop" предложен Ватсоном. Вирус разводят в воде или в растворе, содержащем 0,2 мг ВСА/мл в случае вирусных препаратов с концентрацией белка ниже 0,2 мг/мл, В любом случае вирус разводят до концентрации 109–1010 частиц/мл. Суспензию смешивают с равным объемом калибровочного материала. Мы рекомендуем использовать полистироловый латекс "DOW", содержащий -109 латексных частиц/мл. К полученной смеси добавляют 0,12 мл нейтрального 2%-ного раствора фосфовольфрамата натрия. Одну каплю полученного материала наносят, а затем высушивают на формваровых сетках с ячейками размером: 400 меш. Сетки просматривают под электронным микроскопом при увеличении 40 000. Частицы, видимые под микроскопом, классифицируют как "голые", "покрытые оболочкой" и "покрытые оболочкой". Эти частицы представлены на рис. 5. Непроницаемые, покрытые оболочкой частицы выглядят как плотные белые шарики, однако можно показать их способность количественно превращаться в проницаемые, покрытые оболочкой частицы. Как правило, для характеристики каждого образца вируса просчитывают пять групп из 20 латексных частиц.
1.3 Определение инфекционного титра
Вирусы простого герпеса относительно легко титруются различными методами. Мы обычно используем суспензионный метод либо метод монослойных культур.
1.3.1 Титрование в суспензионной культуре
1. Готовят разведения вируса на культуральной среде. К2 мл каждого разведения добавляют 8-106 клеток ВНК.
2. Суспензию при постоянном перемешивании инкубируют 30 мин при 37°С. Затем добавляют 8 мл 2%-ной КМЦ в культуральной среде и перемешивают с вирусом и клетками. Для данного метода содержание ТС в среде может составлять не более 5%.
3. Приготовленные суспензии разливают на две чашки Петри диаметром 60 мм и инкубируют 2–3 дня при 37°С в атмосфере 5%-ного С02.
Похожие работы
... , жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах. Микробиологические методы Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур ...
... фагами, либо путем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельных вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом освобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких вирусов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем ...
... часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей ...
... через 13, перманганат калия 1 : 1000 через 10 мин. Микроб очень чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, в меньшей степени — к пенициллину и синтомицину, устойчив к мицелину и колимицину. Эпизоотология. В естественных условиях болеют овцы независимо от возраста, пола и породности. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши, менее восприимчивы морские свинки, голуби. ...
0 комментариев