Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс

2.8. Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс

 

Группу самцов линии Вистар, поместив в барокамеру и снизив давление до 22 кПа, подвергли острой гипобарической гипоксии, соответствующей подъему на высоту 11500 м. Те животные, что выдерживали гипоксию в течение 10-15 минут, считались высокоустойчивыми. Низкоустойчивые крысы выдерживали эту высоту только в течение полутора минут. Среднеустойчивых крыс в эксперимент не брали. Адаптация низкоустойчивых крыс проводилась методом интервальной нормобарической гипоксии. Для этого животные помещались в камеру с контролируемой подачей воздуха. В течение двенадцати дней животным ежедневно по пять раз в день подавался воздух с вдвое сниженной концентрацией кислорода в течение 10 минут с трехминутными перерывами, во время которых животным подавался воздух с нормальной концентрацией кислорода.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа

1 2 3 4 5 6

Выделение белка с м. м. 55 кДа из внутренней мембраны митохондрий печени крыс проводили методом водно-этанольной экстракции [3]. Очистка белка проводилась методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы в качестве носителя. Присутствие белка во фракциях обнаруживали с помощью SDS-электрофореза в 10%-ом ПААГ (рис 3).

Рисунок 3. SDS-электрофорез фракций после повторной хроматографии. На треке 1 – маркер. На треках 2,3 – белок с Мr 55 кДа (фракции с 250 мМ КСl)

Дополнительная проверка фракций проводилась на приборе для определения проводимости искусственных бислойных мембран. При встраивании белка фракции, содержащих канальную субъединицу мито-К⁺_АТФ обнаруживалась проводимость мембран, ингибируемая АТФ (рис 4).

Для дополнительной очистки проводили повторную хроматографию активной фракции. Для окончательной очистки белка до электрофоретически гомогенного состояния проводился нативный электрофорез активной фракции с последующей элюцией белка с геля.

Рисунок 4. К⁺-транспортирующая АТФ-ингибируемая активность белка с молекулярной массой 55 кДа, реконструированного в искусственную мембрану.

Электрофоретически гомогенный АТФ-ингибируемый К⁺-транспортирующий белок с M_r 55 кДа замораживали и накапливали для иммунизации. При выделении вышеописанным методом из 100 г печени крыс получали 30-70 мкг очищенного белка. Иммунизацию кроликов проводили при накоплении 0.2-0.4 мг белка.

3.2. Определение параметров дыхания у крыс с различной устойчивостью к гипоксии и адаптированных к ней

Определение проводилось с помощью кислородного электрода Кларка. Определялась скорость дыхания (V3) и скорость фосфорилирования АДФ (V2) в митохондриях печени и сердца трех групп крыс. Полученные данные представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, митохондрии печени высокоустойчивых к гипоксии крыс скорости дыхания во всех метаболических состояниях, а также в присутствии разобщителя ниже по сравнению с этими скоростями у низкоустойчивых животных. Этот эффект не зависел от наличия К⁺ в среде

Среда	Группы крыс	V2, нмоль О2/мин*мг белка	V3, нмоль О2/мин*мг белка	V4, нмоль О2/мин*мг белка	VДНФ, нмоль О2/мин*мг белка	ДК
С ионами К+	ВУ	8.38±1.14	87.9±3.54	23.24±2.88	179.5±4.88	3.78±0.12
	НУ	14.54±1.68	110.76±4.95	32.9±3.25	181.0±4.27	3.36±0.33
	А	11.46±1.32	68.03±4.76	24.7±2.65	94.4±4.12	2.75±0.21
Без ионов К+	ВУ	8.46±0.93	35.01±3.87	11.61±2.54	112±5.21	3.1±0.26
	НУ	14.6±2.05	64.01±3.24	26.58±3.44	166.78±5.8	2.4±0.19
	А	8.76±1.39	45.95±4.77	19.92±1.76	79.55±4.22	2.3±0.14

Таблица 5. Скорость дыхания в митохондриях печени крыс с различной устойчивостью и адаптированных к гипоксии с использованием двух сред и сукцината в качестве дыхательного субстрата.

инкубации митохондрий. Адаптация к гипоксии низкоустойчивых животных ведет также к снижению всех скоростей, однако, в присутствии ионов калия,

эти скорости дыхания снижаются не столь значительно. Последнее может указывать на активацию транспорта ионов К⁺ в митохондриях при адаптации животных к гипоксии. Следует отметить, что эти эффекты больше проявляются по отношению к скорости дыхания в присутствии субстрата (V2, V4) по сравнению со скоростью АДФ-стимулируемого дыхания (V3). Это может быть связано с увеличением концентрации АТФ в митохондриях после фосфорилирования добавленного АДФ. Как известно, АТФ ингибирует вход катионов К⁺ в митохондрии.

Обнаружено также, что у адаптированных к гипоксии животных дыхательный контроль в среде с ионами К⁺ снижен по сравнению с этим показателем у низкоустойчивых к гипоксии животных. Это снижение наблюдается только в среде, содержащей катионы К⁺, что может указывать на активацию энергозависимых процессов в митохондриях.

Совокупность полученных данных указывает на то, что 1) адаптация к гипоксии ведет к ингибированию работы фосфорилирующей дыхательной цепи, независимо от присутствия или отсутствия ионов К⁺ в среде, вероятно, за счет активации гликолиза и 2) адаптация ведет также к активации знергозависимого входа К⁺ в митохондрии.

Для подтверждения полученных данных у этих же животных были определены параметры АТФ-зависимого транспорта ионов К⁺ в митохондриях, а также количество катионов К⁺ в них.