Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта

3.3. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта

ионов калия в митохондриях

Исследование параметров проводилось на двух моделях:

А) Модель энергозависимого набухания митохондрий.

Увеличение концентрации ионов К⁺ матриксе провоцирует осмотически облигатное поступление воды и, следовательно, набухание митохондрий. Изменение объема митохондрий влияет на их оптическую плотность. Следовательно, активность канала можно определить методом динамической спектрофотометрии.

Скорость энергозависимого входа ионов К⁺ определялась у крыс с различной устойчивостью, а также адаптированных к гипоксии крыс. Данные представлены в таблице 6.

Из полученных данных следует, что скорость энергозависимого транспорта К⁺ значительно выше у высокоустойчивых и адаптированных к гипоксии крыс по сравнению с низкоустойчивыми животными.

Таблица 6. Энергозависимый вход калия в митохондрии печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных.

Б) Модель энергозависимого набухания митохондрий.

При сильном разобщении митоК⁺_АТФ способен опосредовать выход ионов К⁺ из матрикса, то есть обращать свою работу, наблюдаемую в физиологических условиях. Показано, что эта активность ингибируется АТФ, что доказывает специфичность выхода ионов К⁺ в данной модели именно через этот канал.

Скорость выхода катионов К⁺ определялась у всех групп крыс.

Данные полученные на модели ДНФ-индуцируемого выхода ионов К согласуются с данными, полученными на модели энергозависимого набухания митохондрий. То есть, указывают на изначально большую активность канала у высокоустойчивых крыс и повышение активности канала при адаптации. Данные представлены в таблице 7.

Таблица 7. Скорость ДНФ-индуцируемого выхода К+ из митохондрий печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных.

3.4. Определение количества ионов К⁺ в митохондриях

различных групп крыс

Количество калия измеряется К-селективным электродом после добавления в среду тритона Х-100. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8. Количество ионов калия в митохондриях печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных.

Исследования показали, что концентрация калия в МХ высокоустойчивых и адаптированных крыс ниже, чем у низкоустойчивых животных. Полученные данные указывают, что адаптация ведет не только к активации митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, но и системы выброса калия из митохондрий, осуществляемого, обычно, К⁺/Н⁺-обменником. Таким образом, при адаптации активируется калиевый цикл в митохондриях.

Известно, что активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий, которое ведет к снижению мембранного потенциала. Согласно данным, обсуждаемым в обзоре, незначительное снижение мембранного потенциала ведет к существенному уменьшению продукции супероксиданиона [34]. Таким образом, митоК⁺_АТФ участвует в регуляции образования АФК в митохондриях.

Недавно был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоК_АТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [42]. Показано, что УДФ, а также УМФ и уридин обладают кардиопротекторными свойствами [9,40]. Использование метаболического активатора канала в качестве лекарственного средства будет иметь ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать, и они не обладают побочными эффектами, присущими лекарственным препаратам.

1.         Выделен белок с молекулярной массой 55 кДа, являющийся канальной субъединицей митоК_АТФ, изучены его некоторые физико-химические свойства.

2.         При адаптации к гипоксии уменьшается скорость дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях, независимо от присутствия или отсутствия К⁺ в среде.

3.         Показано, что скорость как ДНФ-индуцированного выхода, так и энергозависимого входа ионов К⁺ в митохондрии выше у высокоустойчивых крыс по сравнению с низкоустойчивыми и повышается при адаптации.

4.         Количество ионов К⁺ в митохондриях у высокоустойчивых ниже, а у адаптированных существенно ниже, чем у низкоустойчивых.

Список литературы

1.         Лукьянова Л. Функционально-метаболические особенности животных с различной индивидуально резистентностью к гипоксии. // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. - 2004, с. 156-170

2.         Миронова Г., Маслова Т., Федотчева Н., Миронов Г. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. - Л., Наука; 1986; 64-68.

3.         Миронова Г., Скарга Ю., Григорьев С. и др. АТР-зависимый калиевый канал митохондрий печени крысы. I. Выделение, очистка и реконструкция канала в БЛМ.// Биологические мембраны -1996; Т.13, № 4: 396-404.

4.         Миронова Г., Федотчева Н., Макаров П., Проневич Л., Миронов Г.П. Белок из митохондрий сердца быка, индуцирующий канальную калиевую проводимость бислойных липидных мембран. // Биофизика, 1981 - 26(3): 451-457.

5.         Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Роль свободнорадикальных процессов в адаптации организма к изменению уровня кислорода// Проблемы гипоксии, 2004 – С. 112-138.

6.         Скарга Ю.Ю., Долгачёва Л.П., Федотчева Н.И, Миронова Г. Влияние антител к митохондриальному К⁺-транспортирующему белку на транспорт К⁺ в митохондриях печени крысы. // Укр. Биохим. Журнал - 1987 - 59(6): 54-59.

7.         Aguilar-Bryan L., Nichols C., Wechsler J. et al. Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion.// Science – 1995 - 268: 423-426.

8.         Alekseev A.E., Brady P.A., Terzic A. Ligand-insensitive state of cardiac ATP-sensitive K⁺ channels. Basis for channel opening. //J. Gen. Physiol., 1998 - 111: 381-394.

9.         Aussedat J, Ray A, and Rossi A. Uridine Incorporation in normal and ischaemic perfused rat heart.// Mol. Physiol, 1984 - 6: 247-56.

10.       Bajgar R., Seetharaman S., Kowaltowski A.J., Garlid K.D., Paucek P. Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial) ATP-sensitive potassium channel in brain. //J. Biol. Chem. -2001 - 276: 33369-33374.

11.       Beckman K., Ames B. Mitochondrial aging: open questions.// Ann. NY Acad.Sci. - 1998 - V 854. p 118-128.

12.       Bednarczyk P., Dolovy K., Szewczyk A. Matrix Mg²⁺ regulates mitochondrial ATP-dependent potassium channel from heart.// FEBS., 2005 - 579: 1625-1632.

13.       Bhattacharyya D. Purification and functional characterization of a low-molecular-mass Ca²⁺,Mg²⁺- and Ca²⁺-ATPase modulator protein from rat brain cytosol// Biochem. J – 1998 vol 330 p 95- 101

14.       Chaves E., Yung D., Brierley G. Energy-dependent exchange of K⁺ in heart mitochondria, K⁺ efflux. Arch. Bioch. //Biophys. 1977 - 183: 460-470.

15.       Dahlem Y., Horn T., Butinas L., Gonoi T., Wolf T., Siemen D. The human mitochondrial KATP channel is modulated by calcium and nitric oxide: a patch-clamp approach.// Biochеm. Biophys. Acta., 2004 - 1656: 46-56.

16.       D’Hahan N., Moreau C., Prost A., Jacquet H., Alekseev A., Terzic A., Vivaudou M. Pharmacological plasticity of cardiac ATP-sensitive potassium channels toward diazoxide revealed by ADP. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1999 - 96: 11962–11967.

17.       Diwan J.J., Haley T., Sanadi D.R. Reconstitution of K⁺ transport with 53 kDa mitochondrial protein.// Biochem Biophys Res Commun., 1988 - 153: 224–230.

18.       Fedotcheva N.I., Sharichev A.A., Mironova G.D., Kondrasheva M.N. Inhibition of succinate oxidation and K⁺ transport in mitochondria during hibernation. Comp.// Biochem. Physiol, 1985 - 82B: 191-195.

19.       Ferranti R., Da Silva M., Kowaltowski A. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel opening decreases reactive oxygen species generation. // FEBS Lett., 2003 - 536(1-3): 51-5.

20.       Fikret E., Guido M., Gassanov N. et al. Testosterone induces cytoprotection by activating ATP-sensitive K⁺ channel in the cardiac mitochondrial inner membrane.// Circulation, 2004 - 110(19): 3100-3107.

21.       Flohe L. et al. Redox regulation of NF-kappa B activation//Free rad biol med –1997 – vol 22 – p 1115 –1126.

22.       Forbes R.A., Steenberger C., Murphy E. Diazoxide-induced cardioprotection requires signaling through a redox-sensitive mechanism.// Circ. Res. – 2001 - 88: 802-809.

23.       Garlid K.D., Paucek P., Yarov-Yarovoy V. et al. Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K⁺ channels: possible mechanism of cardioprotection.// Circ. Res.- 1997 - 81: 1072-1082.

24.       Garlid K. Unmasking the mitochondrial K/H exchanger: tetraethylammonium-induced K⁺ loss.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1979 - 87(3): 842-7.

25.       Garlid K.D., Beavis A.D. Evidence for the existence of an inner membrane anion channel in mitochondria.// Biochеm. Biophys. Acta – 1986 - 273: 13578-13582.

26.       Garlid K. Peter Mitchell, 1920-1992.// J Bioenerg. Biomembr.- 1992 - 24(5): 515-6.

27.       Garlid K.D., Paucek P. The mitochondrial potassium cycle.// IUBMB Life.-2001- 52: 153-158.

28.       Graven, K. K., L. H. Zimmerman, E. W. Dickson, G. L. Weinhouse, and H. W. Farber. Endothelial cell hypoxia associated proteins are cell and stress specific.// J. Cell. Physiol.- 1993 - 157: р. 544-554

29.       Grigoriev S., Skarga Y.Y., Mironova G.D., Marinov B.S. Regulation of mitochondrial K_ATP channel by redox agents.// Biochim. Biophys. Acta., 1999 - 1410(1): 91-96.

30.       Grover G., Garlid K. ATP-sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology.// J.Mol.Cell Cardiol., 2000 - 32: 677-695.

31.       Inoue I., Nagase H., Kishi K. & Higuti T. ATP-sensitive K⁺ channel in the mitochondrial inner membrane.// Nature - 1991 - 352: 244-247.

32.       Kaplan-Bresler A. Metmyoglobin oxidation during electro transport reactions in mitochondria. // J.Gen.Physiol. - 1965 - 48: 685-98.

33.       Kondrashova M., Mironova G. Oxygen requirements for ADP phosphorylation under conditions of cyanide block.// Biokhimia, 1971 - 36(4): 864-865.

34.       Korshunov S., Skulachev V., Starkov A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.// FEBS Letters 416 - 1997 – р. 15-18.

35.       Krenz M., Oldenburg O., Wimpee H. et al. Opening of ATP-sensitive potassium channels causes generation of free radicals in vascular smooth muscle cells.// Basic Res. Cardiol. – 2002 - 97: 365-373.

36.       Lacza Z., Snipes J., Kis B., Szabo C., Grover G., Busija D. Investigation of the subunit composition and the pharmacology of the mitochondrial ATP-dependent K⁺ channel in the brain.// Brain Res. – 2003 - 994: 27-36.

37.       Li X.Q., Hegazy M.G., Mahdi F. et al. Purification of f reconstitutively active K⁺/H⁺ antiporter from rat liver mitochondria.// J. Biol. Chem. - 1990 - 265: 15361-15322.

38.       Liaudet L., Soriano F., Szabo C. Biology of nitric oxide signaling. // Crit.Care Med – 2000 - 28: N37-N52.

39.       Lu Ch., Halvorsen S. Channel activators regulate ATP-sensitive potassium channel (KIR6.1) expression in chick cardiomyocytes.// FEBS Lett. – 1997 - 412: 119-125.

40.       Matsushita S, Fanburg B. Pyrimidine nucleotide synthesis in the normal and hypertrophying rat heart. Relative importance of the de novo and “salvage” pathways.// Circ. Res. – 1970 - 27: 415-28.

41.       Maulic N., Goswami S., Galang N., Das D. Differential regulation of Bcl-2, AP-1 and NF-kappaB on cardiomyocyte apoptosis during myocardial ischemic stress adaptation.//FEBS Lett. – 1999 – vol. 443 p. 331-336

42.       Mironova G., Negoda A., Marinov B., Paucek P., Costa A., Grigoriev S., Skarga Yu., Garlid K. Functional distinctions between the mitochondrial ATP-dependent K⁺ channel (mito K_ATP) and its inward rectifier subunit (mitoKIR).// JBC - 2004 - 279(31): 32562-32568.

43.       Mironova G.D., Skarga Yu.Yu., Grigoriev S.M., Negoda A.E., Kolomytkin O.V., Marinov B.S. Reconstitution of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel into bilayer lipid membrane.// J. Bioenerg. Biomembr. – 1999 - 31(2): 157-161.

44.       Mitchel P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism.// Nature – 1961- 191: 144-148.

45.       Nakae Y., Kwok W.M., Bosnjak Z.J., Jiang M.T. Isoflurane activates rat mitochondrial ATP-sensitive K⁺ channels reconstituted in lipid bilayers.// J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003 - 284: 1865-1871.

46.       Noma А. ATP-regulated K⁺ channels in cardiac muscle.// Nature – 1983 - 305: 147-148.

47.       Notsu T., Ohhashi K., Tanaka I., Ishikawa H., Niho T., Fukutake K., Mizota M. 5-Hydroxydecanoate inhibits ATP-sensitive K⁺ channel currents in guinea-pig single ventricular myocytes.// Eur. J. Pharmacol.- 1992 - 220: 35 - 41.

48.       Ohnishi S.T., Ohnishi T., Muranaka S. et al. A possible site of superoxide generation in the complex I segment of rat heart mitochondria.// J. Bioenerg. Biomembr. – 2005 - 37 (1): 1-15.

49.       Ohno-Shasaku T., Kubota T., Yamaguchi J. et al. Reciprocal effects on Ca²⁺ and Mg-ATP on the “run-down” of the K⁺ channels in the opossum kidney cells.// Pflugers Arch.- 1989 - 413: 562-564.

50.       Oldenburg O., Cohen M.F., Downey J.M. Mitochondrial K_ATP channels in preconditioning.// J Mol. Cell. Cardiol. – 2003 - 35: 569-575.

51.       O’Rourke B. Evidence for mitochondrial K⁺ channels and their role in cardioprotection.// Circ.Res. – 2004 - 94: 420-432.

52.       Paradies G., Petrosillo D., Pistolese M. et al. Decrease in mitochondrial complex I activity in ischemic/reperfused rat heart: involvement of reactive oxygen species and cardiolipin.// Circ. Res. – 2004 - 94: 53-59.

53.       Paucek P., Mironova G., Mahdi F., Beavis F., Woldegiorgis G., Garlid K.D. Reconstruction and partial purification of the glibenclamide-sensitive, ATP-sensitive K⁺ channel from rat liver and beef heart mitochondria.// J. Biol. Chem.- 1992. - 267(36): 26062-26069.

54.       Raha S., Robinson B. Mitochondria oxygen free radicals and apoptosis// American Journal of Medical genetics - 2001- V.106 p. 62-70.

55.       Rajesh K., Sasaguri S., Zhitian Z. et al. Second window of ischemic preconditioning regulates mitochondrial permeability transition pore by enhancing Bcl-2 expression.// Cardiovasc. Res. – 2003 - 59: 297-307.

56.       Rottenberg H., Solomon A.K. Energy linked K⁺ uptake in mitochondria.// Biochem. Biophys Res. – 1965 - 20: 85-92.

57.       Sasaki N., Sato T., Ohler A., O’Rourke B., Marban E. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels by nitric oxide.// Circulation – 2000 - 101: 439-445.

58.       Sato T, Sasaki N, O’Rourke B, Marbán E. Nicorandil, a potent cardioprotective agent, acts by opening mitochondrial ATP-dependent potassium channel.// J. Am. Coll. Cardiol. – 2000 - 35: 514–518.

59.       Schild L.R.T., Reiser M., Horn T.F., Wolf G. et al. Nitric oxide produced in rat liver mitochondria causes oxidative stress and impairment of respiration after transient hypoxia.// FASEB J. – 2003 - 17: 2194-2201.

60.       Sheffer I. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives// Mitochondrion – 2001 – V. 1 N.1 p. 3-31.

61.       Tsai C., Su S., Chou T., Lee T. Differential effects of sarcolemmal and mitochondrial K_ATP channels activated by 17b-estradiol on reperfusion arrhythmias and infarct sizes in canine hearts.// J. Pharmacol. Exper. Therap. – 2002 - 301: 234-240.

62.       Tucker S.J., Gribble F.M., Zhao C., Trapp S. and Ashcroft F.M. Truncation of Kir6.2 produces ATP-sensitive K⁺ channels in the absence of the sulphonylurea receptor.// Nature – 1997 – 387, p. 179-183.

63.       Ungemach F.R. Free radicals liver injury.// Proc. Int. Meet., (Turin, June 27-29, 1985) - Oxford, Washington DC, - 1985. – P 127-134

64.       Zhang D., Chen Y., Campbell W., Zou A., Gross G., Li P. Characteristics and suproxide-induced activation of reconstituted myocardial mitochondrial ATP-sensitive potassium channel.// Circ. Res. – 2001 - 89: 1177-1173.

65.       Zhu H., Dong J., Zhu W., Ding H., Zhou Z. ATP-dependent potassium channels involved in cardiac protection induced by intermittent hypoxia against ischemia/reperfusion injury. // Life Sci. – 2003 - 73: 1275-1287.

Похожие работы

Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию

Скачать

118823

4

24

... м, в течение 10-15 мин. Группа низкоустойчивых (НУ) животных выдерживала эту высоту только в течение 1-1.5 мин. Глава 5. Результаты и обсуждения   5.1 Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии В этом разделе работы исследовались такие показатели, как дыхание МХ, скорость АТФ-зависимого К+ транспорта, ...