АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ

1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ

В 1981 г. из внутренней мембраны МХ был выделен К⁺-селективный канал (митоК_АТФ) [Миронова и др., 1981], который ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)]. В 1991 г. этот канал был впервые обнаружен во внутренней мембране МХ методом пэтч-кламп [Inoue et al., 1991], позднее появились аналогичные работы других исследователей [Nakae et al., 2003; Fikret et al., 2004; Dahlem et al., 2004; Bednarczyk et al., 2005]. В настоящее время канал активно изучается, поскольку обнаружено, что он участвует в адаптации организма к гипоксии [Garlid et al., 1997]. В настоящее время основными методами выделения АТФ-ингибируемого МХ калиевого канала (митоК_АТФ) является метод водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; Миронова и др., 1996 (I)] и солюбилизация белка-канала из мембраны Тритоном Х-100 с последующей очисткой ионообменной хроматографией. При этом митоК_АТФ канал выделяют в виде белка с молекулярной массой 55 кДа [Mironova et al., 2004].

1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала

Так как митоК_АТФ имеет ряд общих свойств с цитоК_АТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Mironova et al., 1999] и состоит из канальной субъединицы [Mironova et al., 2004] и регуляторной [Bajgar et al., 2001]. Белок с м. м. 55 кДа, выделенный из внутренней мембраны МХ печени крысы, является, по-видимому, канальной субъединицей митоК_АТФ. При встраивании в БЛМ этот белок формирует АТФ-зависимые каналы (митоKIR). Активность этих каналов не блокируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоК_АТФ 5-ГД, и не активируется кромакалимом и ддиазоксидом. Однако эти препараты влияют на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных МХ, где есть обе субъединицы канала [Mironova et al., 2004].

МитоК_АТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной масой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, был назван митоKIR (от англ. Inward rectifying) [Mironova et al., 2004] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (от англ. sulphonylurea) (Рис. 3) [Mironova et al., 1999; Bajgar et al., 2001].

К_i для АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR выше, чем в интактных МХ и Mg²⁺ для этого ингибирования не требуется. Тогда как для АТФ-ингибирования канала, локализованного в интактных МХ, присутствие магния было необходимо [Mironova et al., 2004]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевин на цитоKIR и целый цитоК_АТФ [Tucker et al., 1997]. Известно, что основной участок связывания АТФ в цитоК_АТФ локализован на канальной субъединице. Регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [Tucker et al., 1997].

Рис.3. Рабочая модель структуры МХ АТФ-зависимого К+ канала [Mironova et al., 2004]

Приведенные выше результаты исследований митоК_АТФ подтверждают предположение о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей целого митоК_АТФ. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с м.м. 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [Bajgar et al., 2001].

В то же время, результаты исследований, проведенных на МХ сердца, с использованием антител на Kir6.1 и Kir6.2, а также на SUR1 и SUR2, показали, что в МХ кардиомиоцитов присутствуют Kir6.1 и Kir6.2, но нет ни SUR1, ни SUR2. Однако в них обнаруживается SUR2-подобный белок, который, возможно, является сплайсированным вариантом SUR2 [Lacza et al., 2003 (I)].

При исследовании митоК_АТФ мозга, близкого по структуре к цитоК_АТФ [Lacza et al., 2003 (II)], с использованием АТ к KIR6.1 и KIR6.2, а также SUR1 и SUR2 субъединицам цитоК_АТФ было показано, что очищенные МХ мозга содержат преимущественно KIR6.1 и, в меньшей степени, KIR6.2 и не содержат SUR1 и SUR2. Согласно выводам авторов, в формировании митоК_АТФ мозга участвует укороченный вариант SUR2 или белок, подобный по структуре SUR2. Кроме того, показано, что МХ мозга содержат в 8 раз больше KIR6.1 и SUR2-подобного белка, по сравнению с общим белком ткани мозга, что подтверждает локализацию этих белков в МХ [Lacza et al., 2003 (II)]. Тот факт, что м.м. митоKIR мозга несколько ниже (50 кДа), чем у митоKIR печени [Mironova et al., 1999; 2004], предполагает наличие тканевой специфичности в структуре каналов.

Было показано, что при встраивании в липосомы или липидные бислойные мембраны комплекса митохондриальных белков, состоящего из АТФ связывающего кассетного белка-1 (mАВС1 от англ. Mitochondrial binding casset), АТФ-азы, сукцинатдегидрогеназы, аденилаттранслоказы и фосфатного переносчика, в мембране образуются чувствительные к АТФ и глибенкламиду каналы [Ardehali et al., 2004]. Это послужило основой для другого варианта модели субъединичной организации митоК_АТФ [Ardehali and O'Rourke, 2005]. Однако нельзя исключить наличие в этом белковом комплексе других митохондриальных белков, включая митоKIR, тем более что белок с м.м. 55 кДа в нём присутствует. Поcкольку этот мультикомплекс в липосомах индуцировал открытие неспецифической Са²⁺-зависимой поры в присутствие ионов Са²⁺ [Ardehali et al., 2004], это говорит о возможном загрязнении исследуемого комплекса порином и другими белками. Было показано, что один из белков этого комплекса, а именно mАВС1, играет важную роль в защите клеток миокарда от окислительного стресса [Ardehali et al., 2005]. Однако кардиопротекторное действие этого белка не снималось ингибиторами митоК_АТФ - глибенкламидом и 5-НD. Поэтому, по мнению авторов, пока не получено достаточно доказательств для утверждения того, что mАВС1, имеющий, также как и митоКIR, м.м. 55 кДа, является частью митоК_АТФ.

Таким образом, вопрос структуры митоК_АТФ по-прежнему остается открытым. В связи с чем, в представленной работе была предпринята попытка определить относится ли белок с м.м. 55 кДа, выделяемый из внутренней мембраны МХ методом водно-этанольной экстракции, к системе АТФ-зависимого транспорта К⁺. Также, был проведен анализ гомологии структуры исследуемого белка последовательностям известных белков.

Глава 2. Модуляторы