Гемофилия А

10.4.3 Гемофилия А.

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное

наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в

системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора

YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х

компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном

F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-

зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-

ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-

рует его активность.

Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-

жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая

длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-

дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009

нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность

(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806

п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в

интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-

известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами

молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-

роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в

направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый

экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие

его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется

он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена

экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;

Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22

оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-

ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-

тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-

нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб

в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые

копии гена F8A (Lakich et al.,1993).

Во время процессинга первичного белкового продукта гена

F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-

щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В

плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого

гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и

N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с

гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-

личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-

тивность белка сохранена, но его количество резко снижено

(McGinnis et al.,1993).

Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -

семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают

в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal

et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,

что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-

ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме

того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,

могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что

вероятность повторного рождения больного ребенка у них также

повышена.

Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-

ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-

мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-

ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis

et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-

на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-

кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них

представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,

Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах

встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на

основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего

большинства мутаций гена F8C характерно практически полное

отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по

гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение

составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-

женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-

ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-

лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А

(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена

является гомологичная рекомбинация между идентичными после-

довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22

F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на

расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).

Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-

гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,

связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-

тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-

ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-

зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et

al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1

последовательности представляют собой специфическое для ге-

нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-

торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и

состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба

L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-

ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et

al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10

F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-

мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-

конструируемые аминокислотные последовательности были высоко

идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.

Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-

ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-

щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-

зиции.

Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-

ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c

последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1

(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия

мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные

методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют

полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-

лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-

генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,

1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).

Учитывая наличие функционально активной формы белка

фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии

этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-

ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо

на введение в организм больного соответствующей кДНК,

обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-

ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого

гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о

получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен

ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты

полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-

левания находится на стадии экспериментальных разработок

(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов

человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная

проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-

ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена

могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены

невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-

ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-

ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,

гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-

равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные

модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что

клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач-

нутся уже в ближайшем будущем.