Основные векторные системы

9.4.1. Основные векторные системы.

В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.

Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-

муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-

лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-

кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую

последовательность определенного гена, инсертированную в

экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием

сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от

многих параметров, главным из которых является необходимый

уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-

держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-

та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-

цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию

либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для

генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-

ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген

(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-

изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-

дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-

мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции

удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-

лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-

териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не

способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.

Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в

клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-

ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение

через клеточные мембраны.

9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в

клетки эукариот.

Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно

проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных

клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.

Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-

жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где

обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только

небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает

в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-

жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-

ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,

в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и

низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1

года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-

риллах (Hansen et al.,1991).

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в

ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции

(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания

трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-

леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи

электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-

рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми

или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод-

ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди-

ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для

клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь

метод бомбардировки, который при наличии специального генно-

го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et

al., 1990).

Для повышения эффективности переноса обычно используют

системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо-

действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег-

чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс-

твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой

доставки является система кальций-фосфатной копреципитации,

широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более

сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет

собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий

создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс-

трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка-

честве лигандов используются специфические белки, такие как

трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован-

ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую-

щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген-

ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную

доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри-

мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и

эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно

присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК

катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).

Важным компонентом системы является аденовирус или его

N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу-

зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн-

досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес-

ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов

обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс-

трукций, их несомненную перспективность для генной терапии

in vivo (Hodgson, 1995).

Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и

физико-химического подхода при конструировании систем для

переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно-

вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции

эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа-

га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер-

тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили-

зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз-

мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген

оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую

какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной

поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес-

печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью

были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю-

щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после-

довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель-

ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что

во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер-

нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно

функционирует.

Направленный перенос генов во многие типы клеток, со-

держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен

при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в

этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает

прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде-

альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре-

цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг-

менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые

находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб-

ная система разработана для рецептор-опосредованного генного

переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова-

нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли-

мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор

транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет-

ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо-

цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции

эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли-

зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной

ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под-

ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы

клеток.