Гемофилия B

10.4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван-

ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента

средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок

(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных

остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-

лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак-

тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по-

липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно

связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX

циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не

произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего

пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се-

риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак-

тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль-

ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо-

ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо-

кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.

Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни-

кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et

al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от

отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо-

лированном случае вероятность гетерозиготного носительства

мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая

корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от

него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в

момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав-

ляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге-

мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти-

дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию

стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-

раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной

частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети-

лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG

динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота

G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в

других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG

динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии

(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание

(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema

et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи-

лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен-

ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или

акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты

сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена

произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо-

торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана

Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз-

расту половозрелости наступает улучшение многих клинических

показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.

Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут

приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на

стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного

ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству

транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия B была использована как модель для выработки

стратегии генетического консультирования при моногенных за-

болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген-

ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв-

ляется составление национальных баз данных молекулярных де-

фектов и специфических методов их диагностики. В частности,

основываясь на подобной информации, авторы провели характе-

ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с

гемофилией B шведского и английского происхождения и только

в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как

непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-

вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма

в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в

положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин

и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-

фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей

детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-

вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных

биологических моделей способствовали быстрому прогрессу

исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее

время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-

ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в

опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных

системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-

дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в

первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали

экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-

шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся

в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et

al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена

трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-

бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При

этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение

более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-

тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об

успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным

мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-

ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo

рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный

скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-

листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-

лии В - событие самого ближайшего будущего.