Секвенирование последовательностей ДНК

1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного

ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-

ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-

ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-

ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул

ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,

однако, определение нуклеотидной последовательности протя-

женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-

дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-

ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -

метод Сэнджера. В первом случае используют химическое

расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют

нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез

на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так

как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-

го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-

руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют

секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-

нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-

ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-

ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного

участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную

смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,

один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-

рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют

один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов

- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на

место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-

щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и

тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-

ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-

ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-

рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов

может быть определен, а значит и определена локализация ди-

дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов

в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем

геле может быть определена первичная последовательность все-

го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте

этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.

Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК

в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет

назад оценивалась в 1$.

В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-

варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных

на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых

участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-

ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-

залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс

одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-

шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология

автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным

для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-

лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-

нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-

ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается

автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение

в реализации программы Геном человека. По последним данным,

разработка автоматических секвенаторов позволила снизить

стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-

ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах

фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-

но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.

В последние годы активно разрабатываются принципиально

новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-

ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой

последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-

ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский

и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для

этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых

пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-

да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-

рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-

деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество

возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-

емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют

с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется

только с теми октануклеотидами, последовательности которых

комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-

бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-

дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной

компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-

тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод

позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет

автоматизации процесса.