Муковисцидоз

10.4.1 Муковисцидоз.

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) -

самое распространенное моногенное наследственное заболевание

у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь,

молекулярные основы которой определены методами позиционного

клонирования без использования каких-либо данных о структур-

ных перестройках в области локализации предполагаемого гена.

Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или

крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи-

тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это

было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом

грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро-

мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об

истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе

функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую-

щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара-

нов, Гинтер, 1994).

Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе-

лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane

regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка-

налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб-

раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от

типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко-

висцидозе может быть полностью или частично нарушенной.

К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500

мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра-

ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является

мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508

положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо-

дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи-

вает определенный градиент распространения с севера на юг и

с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до

50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части

России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-

мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является

мутация W1282X (33%).

Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко-

висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности

экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде-

ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле-

точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута-

ции, её локализации и структуры аномального белкового про-

дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не-

которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя

трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости-

гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим

объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару-

шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W

и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не

затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но

функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление

процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли-

ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и

двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной

из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией

функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа-

лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа-

цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци-

онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993).

Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще

в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна-

руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя-

щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза

у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер-

та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,

обусловленного аллельными сериями.

В настоящее время в России доступны идентификации по

наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом

(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность

основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле-

дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),

394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на-

шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко-

висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се-

мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные

сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости

(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми-

нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена

СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et

al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При

отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным

сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи-

мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер-

ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;

Баранов и др.,1991).

Методами направленного мутагенеза (gene targeting

см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании

осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей

муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et

al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-

яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия

проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,

что различные мутации этого гена по-разному реализуются в

фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных

линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -

поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии

наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход-

ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии

представляют собой идеальные модели для исследования молеку-

лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ-

ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте-

рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге-

нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7

центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и

Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген-

ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо-

дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические

испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70

пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача-

тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль-

тур.